[0001]一种低抗原性重组葡激酶突变体及制备方法
[0002]技术领域
[0003]本发明属突变或遗传工程领域。
[0004]背景技术
[0005]心肌梗塞对人类健康有较大的危害，且死亡率很高，溶栓治疗是临床急救和常规治疗的主要手段之一。研究表明，在众多的溶栓药物中，葡激酶(Staphylokinase，SAK)是目前在溶栓效果和特异性上唯一可与tPA媲美的新型溶栓药物。天然的SAK是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，分子量15.5kDa。20世纪90年代，SAK的纤维蛋白选择性被发现，因此引起人们的广泛关注。国内已有单位获得新药证书，而且由于利用原核细胞发酵和纯化生产，其市售价格会相对较低，因此在临床应用中具有一定的竞争优势。但它与许多具有特殊功能的外源蛋白一样，SAK在临床应用中也导致一些免疫反应，尤其是重复使用时其诱导的中和抗体对疗效有很大的影响。同时，SAK的免疫原性限制了日常的预防或恢复治疗的应用。
[0006]因此如何保障rSAK在同类药品中的优势地位、如何更好地应用于临床治疗、如何扩大rSAK作为溶栓药物的应用范围是制药企业面临的巨大挑战。
[0007]发明内容
[0008]本发明的目的是利用生物信息学和基因缺失突变技术对SAK分子的抗原分布特性进行了分析，利用缺失和氨基酸替换方法对野生型SAK分子进行定向修饰，最大限度地屏蔽SAK分子中的T、B淋巴细胞表位，同时去除ASKN端的6个氨基酸，构建分子量相对减小，抗原性降低的SAK突变体。利用基因体外重组技术构建高效表达SAK突变体的工程菌，研究进行SAK分子修饰后，可溶性表达的比例有所降低。利用离子交换和分子筛等层析技术纯化表达的重组蛋白，制备的重组蛋白纯度可达95％以上。
[0009]本发明构建的突变体(SAK-M)序列如下：
[0010]GGAAAATATAGAAAAGGCGATGACGCGAGTTATTTTGAACCAACAGGC
[0011]GlyLysTyrArgLysGlyAspAspAlaSerTyrPheGluProThrGly
[0012]CCGTATTTGATGGTAAATGTGACTGGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTGCTATCCCCTCGTTAT
[0013]ProTyrLeuMetValAsnValThrGlyValAspGlyAlaGlyAsnGluLeuLeuSerProArgTyr
[0014]GTCGAGTTTCCTATTAAACCTGGGACTACACTTACAAAAGAAAAAATTGAATACTATGTCGAATGGGCA
[0015]ValGluPheProIleLysProGlyThrThrLeuThrLysGluLysIleGluTyrTyrValGluTrpAla
[0016]TTAGATGCGACAGCATATCAAGAGTTTAGAGTAGTTGCATTAGCGCCAAGCGCAAAGATCGAAGTCACT
[0017]LeuAspAlaThrAlaTyrGlnGluPheArgValValAlaLeuAlaProSerAlaLysIleGluValThr
[0018]TATTATGATAAGAATAAGAAAAAAGAAGAAACGAAGTCTTTCCCTATAACAGAAAAAGGTTTTGTTGTC
[0019]TyrTyrAspLysAsnLysLysLysGluGluThrLysSerPheProIleThrGluLysGlyPheValVal
[0020]CCAGATTTATCAGAGCATATTAAAAACCCTGGATTCAACTTAATTACAGCGGTTGTTATAGAACGTGCG
[0021]ProAspLeuSerGluHisIleLysAsnProGlyPheAsnLeuIleThrAlaValValIleGluArgAla
[0022]注：35位赖氨酸lysAAA变为丙氨酸AlaGCA；74位赖氨酸lysAAA变为谷氨酰氨GlnCAA；80位谷氨酸GluGAA变为丙氨酸AlaGCA；82位天冬氨酸AspGAT变为丙氨酸AlaGCG；130位赖氨酸LysAAG变为丙氨酸AlaGCG；135位赖氨酸LysAAG变为精氨酸ArgCGT；136位赖氨酸LysAAA变为丙氨酸AlaGCG。
[0023]本发明SAK突变体的制备方法
[0024]1.实验材料和设备
[0025]1.1菌株：金黄色葡萄球菌(StaphloCoCCusaureus1.1476)购自国家菌种保藏中心，E.coliDH5，BL21等为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存菌种。
[0026]1.2质粒：T载体购自美国Promega公司，pBV220表达载体大小为3.66kb，是一种温敏型高效表达载体，含有PRPL串联的启动子，cIts857温敏调控基因与PRPL的存在，使该载体可以转化任何受体菌，SD序列的后面紧跟多个克隆位点，为基因的操作提供了便利，为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存。pT-SAK-M为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存。
[0027]1.3酶与生化试剂：BamHI、EcoRI、Taq酶和T4DNA连接酶、小提、大提质粒试剂盒、DNA及蛋白分子量标准等购自美国Promega公司。
[0028]1.4实验器材：PCR仪为美国PE公司产品。电泳仪、层析仪为BIO-RAD公司产品。超净工作台、摇床等为国产。
[0029]2、制备过程
[0030]2.1SAK突变体的构建和鉴定
[0031]从Staphlococcusaureus1.1476株菌体中提取染色体DNA，设计PCR引物，首先获得其N端缺失6个氨基酸SAK突变体基因，然后以它为模板，通过PCR方法将SAK分子中的一些B淋巴细胞表位区段进行修饰，主要包括：第35、74、80、82、130、135和136位氨基酸。通过合成相关的引物序列定点改变这些位点的核苷酸序列，然后通过PCR和退火反应获得预期的突变体基因(图1)。利用双酶切和PCR对构建的突变体进行鉴定(图2)。然后进行核酸序列分析(图3)
[0032]2.2SAK突变体表达载体的构建和鉴定
[0033]利用EcoRI和BamHI双酶切表达载体pBV220和利用PCR拼接的SAK突变体片段，利用T4DNA连接酶连接，转化宿主细菌，利用酶切鉴定筛选阳性克隆。构建表达载体pBV220-SAK-M
[0034]2.3重组SAK突变体蛋白的表达
[0035]将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素(Ap+)的LB培养基中，30℃震荡培养过夜，次日再以5％的浓度接种于LB培养基中，30℃震荡培养2小时至OD600为0.4-0.6之间，将培养物迅速移至42℃水浴中，震荡培养，诱导表达4小时，同时以含有空载体的BL21菌株作为对照，诱导结束后，以12000rpm离心20秒，收取诱导表达的菌体，加入80μlTE缓冲液悬浮菌体，再加入等体积的2X载样缓冲液混匀，100℃煮沸处理5分钟，然后进行SDS-PAGE检测
[0036]2.4重组SAK突变体蛋白的纯化
[0037]将诱导表达菌以PB缓冲液(50mMPBpH7.6，2mMEDTA)洗涤菌体两次，再以2-5倍体积的PBE缓冲液悬浮，置于冰浴中，利用超声破碎仪破碎细菌，破碎结束后，将菌体破碎液倒于离心管中，在4℃条件下12000rpm离心20分钟，取上清备用。利用离子交换负吸附的原理，将破碎后的上清穿过阴离子交换柱(QSephroseFF)，使rSAK衍生体蛋白穿过，菌体蛋白吸附于柱上，收集穿过液。经过纯化后，去掉一部分杂蛋白，使rSAK的纯度得到提高，从而达到初步纯化的作用。
[0038]将经过阴离子交换纯化的蛋白溶液，调pH为6.2，然后经过阳离子交换(SPSephroseFF)的纯化，使rSAK衍生体蛋白的纯度进一步提高。然后，选择Amersham-Phamacia公司生产的SephacrylS-200为凝胶过滤介质，将阳离子交换洗脱液上样，收集洗脱峰。利用SDS-PAGE电泳进行纯度分析(图)，重组蛋白的纯度＞95％。
[0039]本发明的活性测定结果显示，突变体的溶栓活性良好，与野生型相当。利用ELISA方法对其抗原性进行了初步的检测，结果表明，我们构建的SAK突变体具有较低的抗原活性。这一研究结果提示，该突变体可能成为新的溶栓候选药物，为SAK在常规治疗中的重复应用提供了可能性，同时也为SAK在临床上的使用提供了更好的安全保障。其研制成功可使rSAK由单一的急救性药物转变成一种兼急救、恢复性和预防治疗等多用途溶栓药物，使其应用范围大大拓宽，需求量呈数十倍的提高，必将产生巨大的经济效益。
[0040]附图说明
[0041]图1为SAK突变体基因的PCR扩增结果图，图中
[0042]1.子量标准物，2.SAK突变体基因；
[0043]图2为pT-SAK-M的酶切鉴定结果图，图中
[0044]1.子量标准物，2.空载体对照3.pT-SAK-M/双酶切；
[0045]图3为构建的SAK衍生体的核酸序列分析图谱；
[0046]图4为重组表达载体pBV220-SAK-M的鉴定图谱，图中
[0047]1.子量标准物，2.空载体对照3.pBV220-SAK-M/双酶切4.阴性克隆；
[0048]图5为重组表达载体外源基因的表达结果图，图中
[0049]1.蛋白分子量标准2.空载体对照3.pBV220-SAK-M/BL21；
[0050]图6为重组SAK衍生体蛋白的纯化结果图，图中
[0051]1.蛋白分子量标准物2、3：纯化的rSAK衍生体蛋白；
[0052]图7为纯化产物的活性测定图
[0053]A2、A3、A4：测试样品，B1-5、C1-5：参照品的溶圈情况，
[0054]D2、D3、D4：测试样品A2、A3、A4的重复上样。
[0055]具体实施方式
[0056]重组SAK突变体的活性测定
[0057]称取125mg琼脂糖(Biorad电泳级)，加入23ml生理盐水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，纤溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要边加边摇匀，加2.2ml人纤维蛋白原(6mg/ml)，不停地摇匀，混浊后马上倒平板(直径8cm)，4℃冰箱水平放置至少半小时，充分凝固后待用。
[0058]标准品和待测样品的稀释：标准品按如下方法进行对倍稀释：
[0059]管号12345
[0060]生理盐水(μl)500500500500
[0061]参考品溶液(μl)1000500500500500
[0062]参考品活性(AU/ml)25012562.531.2515.625
[0063]待测样品根据标示量稀释至5μg/ml的浓度，待用。
[0064]打孔，点样：
[0065]在形成的纤维蛋白平板内打孔(直径2mm)，每孔点样6μl，每个样品和标准品复孔点样，湿盒(在饭盒内加少量水以保持一定的湿度)于25℃水平放置16h。
[0066]结果计算和检定报告：
[0067]点样平板在黑色背景下纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数(x)为横坐标，以溶圈直径的平均数(四次量取的数值)的对数为纵坐标(y)，采用生物统计软件分析结果。利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，并求得y＝a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据样品的溶圈直径可求得样品的活性。
[0068]结果：经过计算，其溶栓比活性为4.1×104AU/mg。
[0069]重组SAK突变体的抗原性分析
[0070]SAK多抗由研究室自行制备，采用小鼠的腹腔皮下注射免疫，经初步纯化后获得SAK抗体。我们对重组蛋白的抗原性变化进行了初步分析，分别用野生型SAK和构建的SAK衍生体包被96孔板，封闭后洗涤3次，分别加入SAK鼠多抗，37C°温育1h，洗涤5次，加入辣根酶标记的羊抗鼠抗体，温育1h，洗涤5次，加入底物显色，利用2M的H2SO4终止反应，每板作8个复孔，在490nm比较其OD值。
[0071]OD(SAK野生型)＝1.23±0.21
[0072]OD(SAK衍生体)＝0.71±0.32
[0073]可见衍生体的抗原性有所降低，有关抗体的动态变化情况的动物实验正在进行中。
