HPLC法测定血浆中尿嘧啶和二氢尿嘧啶的含量

目的:建立人血浆中内源性尿嘧啶(U)和二氢尿嘧啶(UH2)的HPLC测定方法,为通过UH2/U比值评价体内二氢嘧啶脱氢酶活性提供方法学基础。方法:采用Shim-pack CLC-ODS柱(6mm×150mm,5μm),以0.05mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值为4.0)为流动相,测定U的检测波长为260nm,测定UH2的检测波长205nm。以含3%牛血清白蛋白(BSA)的水溶液配制标准样品和质控样品。以溴尿嘧啶为内标,采用叔丁基甲醚/正丙醇(75:25)为提取溶剂进行两次提取,氮气吹干、复溶后进样分析。结果:U在5～200μg·L-1的范围内线性良好(r=0.9995,n=6),测定的批内变异RSD在1.73%～3.45%之间,批间变异RSD在1.76%～2.53%之间,回收率为96.15%～105.09%;UH2在10～400μg·L-1的范围内线性良好(r=0.9996,n=6),测定的批内变异RSD在3.67%～3.80%之间,批间变异RSD在3.40%～5.74%之间,回收率为101.51%～104.06%。结论:本方法灵敏度高,操作简便易行,为测定体内尿嘧啶和二氢尿嘧啶,进而评价二氢嘧啶脱氢酶活性提供方法学基础。