重组酶聚合酶扩增在铜绿假单胞菌检测中的应用

目的 建立一种优化的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法,用于临床快速检测铜绿假单胞菌. 方法 (1)提取1株铜绿假单胞菌标准菌株DNA模板,采用PCR、实时荧光定量PCR和RPA进行检测,统计3种方法检测的加样时长、扩增时长和检测时长.(2)取1株铜绿假单胞菌标准菌株,复苏摇菌后逐次稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1 ×102、1×101集落形成单位(CFU)/mL7个浓度梯度,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,进行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的灵敏性.(3)取1株铜绿假单胞菌标准菌株和4株阴性对照菌(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、白色念珠菌和恶臭假单胞菌),分别提取DNA模板,行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的特异性.(4)取28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株、1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,行RPA.观察上述菌株是否出现阳性扩增信号,并计算其检出率.所有实验重复3次.采用GraphPad Prism 5.01统计软件对灵敏性结果进行分析. 结果 (1)RPA、PCR和实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌的加样时间均为20 min,其中PCR扩增98 min,凝胶检测20 min,共计138 min;实时荧光定量PCR扩增和检测可同步完成,需90 min,共计110 min;RPA中扩增和检测也可同步完成,需15 min,共计35 min.(2)3种检测方法中恶臭假单胞菌均未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.实时荧光定量PCR和PCR中铜绿假单胞菌检测下限为1×101 CFU/mL,RPA中铜绿假单胞菌检测下限为1×102 CFU/mL.RPA、实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度越高,出现阈值时间越短、循环数越少,即检测到阳性扩增信号的时间越短.实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度为1×101～1×107 CFU/mL时,均能检测到阳性扩增信号.RPA中,铜绿假单胞菌浓度为1×101 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为0;浓度为1×102 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为67％;浓度为1×103～1×107 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为100％.(3)RPA、PCR和实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果,鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及恶臭假单胞菌4种阴性对照菌未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.(4)RPA中,28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株及1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株均出现阳性扩增信号,恶臭假单胞菌未出现阳性扩增信号;29株临床铜绿假单胞菌阳性扩增信号检出率为100％.结论 本研究建立的优化的铜绿假单胞菌RPA快速检测方法,耗时短,灵敏性及特异性强,对临床快速检测铜绿假单胞菌感染具有重要应用价值.