非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流

脑内β-淀粉样蛋白(amyloid-β protein,Aβ)的聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要病理特征.Aβ的神经毒性作用机制与其扰乱神经元Ca2+稳态有密切关系.非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)是近年发展起来的一种利用Fick第一扩散定律和Nernst方程,通过非接触方式检测膜外扩散电位获取离子跨膜流速的最新技术手段.本研究在C57BL/6小鼠海马脑片,利用NMT首次检测了Aβ对谷氨酸(Glu)诱发的Ca2+内流以及细胞外低钙引起的Ca2+外排的影响,并初步探讨了Aβ扰乱神经元Ca2+稳态的相关机制.结果显示:(1)急性给予Glu可诱发海马脑片CA1区神经元产生起始快、继而缓慢衰减的持续性内向Ca2+流;(2) Aβ预处理浓度依赖性地增强海马神经元对Glu的反应性,显著提高给药后5 min内Ca2+内流的平均流速,而NMDA受体拮抗剂D-APV可有效阻断Aβ对神经元Glu反应的这种易化作用;(3)用低钙人工脑脊液急性灌流脑片可引起海马CA1区神经元产生持续的外向跨膜Ca2+流,其大部分可被特异性Na+/Ca2+交换体抑制剂KB-R7943所阻断;(4)Aβ预处理可部分抑制低钙人工脑脊液引起的Ca2+外排.这些结果表明:Aβ引起的细胞内Ca2+超载不仅涉及到Ca2+内流增加,也与其对Ca2+外排的抑制有关;Aβ易化Glu的兴奋毒作用主要是通过NMDA受体介导的,其抑制Ca2+外排的靶点主要是Na+/Ca2+交换体.NMT具有操作相对简单、实时获取结果、非损伤的优点,适用于脑片Ca2+内流和Ca2+外排的长时间测定.因此,本研究不仅为解释Aβ所致Ca2+超载的神经毒性机制提供了新的实验证据,也为开展跨膜Ca2+信号转导机制的脑研究提供了新的技术方法.