Validation of Pepsin-Assisted Extraction and Immunoaffinity-HPLC/DAD Analysis for Vitamin B12 in Seafood

한국은 삼면이 바다로 둘러 쌓여있어 연중 다양한 수산물이 식단에 활용되고 있기 때문에 수산물은 쇠고기나 돼지고기와 같은 육류 자원과 함께 한국 식단에서 비타민 BSUB12/SUB 섭취를 위한 우수한 급원이 되고 있다. 식품 중의 비타민 B1SUB2/SUB는 단백질과 결합된 형태로 존재할 수 있으므로 국내 수산 자원의 비타민 BSUB12/SUB 함량에 대한 신뢰도 있는 데이터베이스 구축을 위해서는 비타민 BSUB12/SUB 추출법에 대한 검증이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 매트릭스가 다른 수산물 4종(바지락, 꽃게, 고등어, 오징어)을 선정하여 pepsin을 이용한 비타민 BSUB12/SUB 추출을 immunoaffinity column을 이용한 clean-up 및 HPLC/DAD 분석에 적용하는 분석법의 유효성을 검증하였다. 시료는 생물을 구입하여 가식 부위만 균질화한 다음 pepsin 처리 없이 추출된 자유 비타민 BSUB12/SUB와 pepsin을 처리하여 결합된 비타민 BSUB12/SUB를 포함한 총 비타민 BSUB12/SUB 함량을 각각 분석하였으며, 이에 대한 분석법 검증(특이성, 민감성, 직선성, 정확성, 정밀성)을 수행하였다. 효소 처리 여부와 상관없이 특이적으로 cyanocobalamin을 분석할 수 있었으며 우수한 직선성(y=2008x－19.757, R²=0.9992)을 나타내었다. 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 pepsin 무처리 시 각각 0.006과 0.061 μg/100 g을 나타내었으나 pepsin 처리 시 약 2배가 높은 0.015와 0.106 μg/100 g을 나타내었다. 인증참고물질 BCR-487(pig liver)을 분석한 회수율 측정에서 pepsin 처리가 99.4%, 무처리 추출이 96.3%로 효소 처리법이 다소 높은 회수율을 나타내었다. 정밀성 시험에서는 pepsin 무처리 추출의 반복성과 재현성이 각각 6.0과 10.5%, pepsin 처리 시 각각 9.4와 13.6%로 나타나 효소를 이용한 추출에서 정밀성이 더 높아지는 것으로 나타났다. 그러나 두 분석법 모두 AOAC에서 제안하는 수용 범위 수준을 충족하는 정확성과 정밀성을 나타내어 식품 중의 비타민 BSUB12/SUB 분석에 적용 가능할 것으로 보인다. Pepsin 처리 추출법을 적용한 immunoaffinity-HPLC 분석법으로 4종 수산물(raw, wet basis)의 비타민 BSUB12/SUB 함량을 분석한 결과, 바지락의 자유와 총 비타민 BSUB12/SUB 함량은 각각 46.9와 55.2 μg/100 g으로 총 비타민 BSUB12/SUB 함량이 유의적으로 높게 나타났으나(P0.05), 꽃게와 오징어의 경우 각각 6.09~6.87 μg/100 g과 2.39~2.45 μg/100 g의 범위를 보이며 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이는 바지락과 고등어의 경우 총 비타민 BSUB12/SUB 함량중에서 각각 약 18%와 20%가 단백질과 결합된 상태로 존재하는 것을 의미하며 이는 pepsin과 같은 효소를 이용한 추출법이 필요하다는 것을 가리킨다 하겠다. 또한, 본 연구의 LOD와 LOQ 결과는 pepsin 처리를 이용한 immunoaffinity-HPLC/DAD 분석법이 식품 중에 낮은 수준으로 존재하는 비타민 BSUB12/SUB를 분석하는 데 적용 가능한 분석법임을 보여준다. Pepsin을 이용한 비타민 BSUB12/SUB 분석은 정밀성과 정확성이 수용 범위 수준이기는 하지만 무처리 분석보다는 높기 때문에 다양한 수산 자원의 매트릭스에 따른 이들의 적용여부는 보다 구체적인 접근 방법을 검토해보는 것이 필요하다 생각된다.