Développement d’une approche originale de cytométrie en flux pour préciser le caractère pathogène des mutants d’ARMC5 (armadillo repeat containing 5) identifiés dans l’hyperplasie macro nodulaire bilatérale primitive des surrénales

Introduction Une mutation germinale inactivatrice du gene ARMC5  est retrouvee a l’etat heterozygote chez 25 % des patients presentant une hyperplasie macro nodulaire bilaterale primitive des surrenales (HMBPS). A ce jour, 69 mutations ont ete identifiees (donnees personnelles et de la litterature). La pathogenicite des mutations faux-sens d’ARMC5 doit etre etudiee. Les premieres etudes suggerent un role pro-apoptotique de la proteine ARMC5 sauvage (ARMC5-WT), altere chez les mutants. Pour quantifier l’apoptose induite par ARMC5-WT et ses variants, une approche de cytometrie en flux a ete mise au point qui mesurait, apres fixation, la fluorescence emise par un anticorps anti caspase-3, dans une population surexprimant ARMC5. Nous travaillons a une procedure simplifiee sur cellules vivantes. Methode Trois lignees cellulaires -HeLa, HEK, H295R- sont transfectees avec un vecteur d’expression etiquete GFP (pIRES-EGFP2), permettant la surexpression d’ARMC5-WT ou d’un mutant connu pathogene : p.L548P. Une construction sans ARMC5 est transfectee en controle. L’apoptose est etudiee dans les HeLa a 12, 14 et 20 h de transfection en utilisant le marqueur membranaire annexine-V conjugue au fluorochrome Alexa-647 mm. Acquisitions sur accuri-C6. Resultats L’apoptose des cellules HeLa surexprimant ARMC5-WT semble etre un phenomene precoce, observable des 14 h de transfection et qui n’est pas induit par la surexpression du mutant p.L548P (respectivement 25, 35 et 23 % de cellules annexine-V positives dans les groupes controle, ARMC5-WT et ARMC5-mute p.L548P). Ces resultats doivent etre confirmes. La procedure est a tester dans les HEK et les H295R. Perspectives Ce protocole devrait etre applique aux mutations faux-sens d’ARMC5 pour preciser leur caractere pathogene.