基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫基因检测方法的建立

目的 建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(Recombinase-aided amplification, RAA).方法 以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系.分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性.结果 建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA.以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL.以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性.结论 成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好.