大鼠胚胎肠神经干细胞体外培养的时间选择及鉴定

目的 探讨大鼠胚胎肠神经干细胞(ENSCs)体外培养时间的选择.方法 在严格的条件控制下,从盛京医院SPF级动物实验室筛选的VSD大鼠的胎鼠和幼鼠作为研究对象,分别取孕16、18、20 d的胎鼠和生后1d的幼鼠,每组各5只.以其肠管做原代培养,在碱性成纤维生长因子(bFGF)、N2添加剂和B27添加剂联合作用下使其稳定增殖,观察其神经球形成的时间及生长速度,并用10％的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用SABC法免疫细胞化学染色检测巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、髓磷脂碱蛋白(MBP)和神经微丝200 (NF-200)的表达,对ENSCs及其分化的细胞进行鉴定.结果 孕16d和孕18 d提取的ENSCs于原代培养后第3天形成肠神经球,孕20 d和生后1d提取的ENSCs于原代培养后第5天形成肠神经球.形成的神经球可以进行传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞(NF-200染色阳性细胞)、星形胶质细胞(GFAP染色阳性细胞)和少突胶质细胞(MBP染色阳性细胞),说明所培养的细胞为肠神经干细胞.结论 采用无血清培养基加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎ENSCs;对于ENSCs体外培养取材时机,选择孕18 d大鼠胚胎为宜.