人ARF4慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系SKOV3中的稳定表达

目的 建立稳定表达人ADP核糖基化因子-4(ARF4)的卵巢癌SKVO3细胞系.方法 构建pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4真核表达载体;经测序验证后转染SKOV3细胞,运用实时定量PCR验证ARF4 mRNA的表达量;再将验证后的重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞进行包装,收集重组慢病毒颗粒LV-ARF4,感染SKOV3细胞后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞系;最后用实时定量PCR与Western Blot测定稳定表达的细胞系内ARF4的表达情况.结果 成功构建出pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4真核表达载体;该载体在SKOV3细胞中可明显上调ARF4 mRNA的表达,并在HEK-293T细胞中成功包装成重组慢病毒颗粒.与对照组相比,实验组SKOV3细胞感染ARF4慢病毒载体后ARF4 mRNA及蛋白的相对表达水平均明显升高,差异均具有统计学意义(均P<0.001).结论 成功构建了重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro/ARF4及慢病毒载体LV-ARF4,并建立了ARF4稳定转染的SKOV3细胞系,为进一步研究ARF4在卵巢癌中的生物学功能奠定了基础.