人CD5信号肽介导犬细小病毒非结构蛋白1(NS1)在真核细胞的分泌型表达

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)是CPV的重要功能蛋白,参与病毒的复制和转录,同时也是宿主细胞的毒性蛋白.为探索其生物学功能,需要制备重组NS1蛋白.本研究采用人(Homo sapiens)CD5信号肽序列介导NS1蛋白在真核细胞中进行分泌表达,以制备高纯度的NS1重组蛋白.首先,根据人CD5信号肽序列(GenBank No.NM_014207.4),设计合成1对两端带有限制性内切酶位点的互补全长CD5信号肽序列(2条寡核苷酸链);然后将2个寡核苷酸链进行退火处理,生成CD5信号肽基因,进而通过酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1-NS1/H的NS1基因5'端,与NS1基因融合,构建形成与His标签融合的NS1分泌型真核表达载体pcDNA3.1-CD5-NS1/H.将该表达载体转染人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293T细胞使其表达,用Ni-NTA琼脂糖胶粒通过亲和层析法从细胞培养基中纯化重组NS1蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,纯化的NS1蛋白纯度达95％以上,并能与抗His标签抗体进行特异结合,表明所构建的表达载体可以介导NS1在真核细胞中进行分泌型表达.为提高表达水平,进一步分析载体用量、转染时间和表达时间对NS1表达的影响,初步确定NS1表达的最适条件为在T75细胞培养瓶中载体用量30μg、转染时间5 h、表达时间48 h.本研究可为进一步探讨NS1的生物学功能提供基础资料.