不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

[目的]筛选不同温度下烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染后枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)差异表达的长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA),研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用.[方法]N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS),48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序.对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90(N.tabacum var.TN90)基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平.通过edgeR筛选差异表达lncRNA (differentially expressed lncRNA,DElncRNA),并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证.通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能.[结果]4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 7 37条已知lncRNA、40 1 69条新lncRNA.其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80％左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度.对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向.靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程.部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势.GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程.KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路.[结论]不同温度(25℃和31℃)条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应.研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据.