共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和 猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化

[目的]对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化.[方法]根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(V P7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列.重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化.[结果]当博奥和百傲两种缓冲液比例为1:1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1:40,在48℃杂交3 h,用0.2％SDS清洗,1000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳.[结论]本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础.