美国白蛾中肠碱性磷酸酶HcALP1与苏云金杆菌3种Bt蛋白的体外结合特性分析

美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害桑树的主要害虫之一.为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白Cry对其作用机制,克隆美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因,并对其编码蛋白的时空表达特异性及与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的结合特性进行分析.根据美国白蛾中肠转录组数据获得碱性磷酸酶基因序列,设计特异引物,PCR扩增得到美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因全长,命名为hcalp1(GenBank登录号为MH796758).该基因开放阅读框为1 629 bp,编码542个氨基酸,预测蛋白质分子质量和等电点分别为60.413 kD和5.83.实时荧光定量PCR和Western blot结果表明,hcalp1在美国白蛾4龄幼虫表达量最高,HcALP1蛋白在4龄幼虫中肠中的表达量也最高.构建原核重组表达载体pET30a-hcalp1,IPTG诱导表达获得分子质量约为70 kD的重组HcALP1蛋白;将Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10原毒素分别经胰蛋白酶消化后与HcALP1重组蛋白进行体外配体印迹试验,发现HcALP1重组蛋白可与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10发生特异结合,推测HcALP1可能为3种Bt蛋白的中肠受体蛋白.