重组脯氨酰内肽酶提取方法改进及活性研究

脯氨酰内肽酶具有水解多肽中脯氨酰残基的能力,具有治疗乳糜泻的潜力,构建高表达量的重组脯氨酰内肽酶、建立保持其高活性的提取方法对于脯氨酰内肽酶的药物开发至关重要.该研究经密码子优化、基因合成,构建了重组鞘氨醇单胞菌脯氨酰内肽酶(SCPEP)的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌.探索建立改进型渗透休克法提取SCPEP,经Ni-NTA纯化、超滤浓缩得到产物.采用分光光度法基于底物Suc-Ala-Pro-pNA评价SCPEP的活性,同时与高压均质法提取的产物进行对比研究.结果 显示,在pH 6.0和pH 7.0的反应体系中,采用改进型渗透休克法提取的SCPEP水解Suc-Ala-Pro-pNA的kcat/KM分别为(56.58±12.00) (mmol/L)-1·s-1和(55.82±15.33) (mmol/L)-1·s-1,而高压均质法提取的SCPEP水解Suc-Ala-Pro-pNA的kcat/KM分别为(24.78±10.63) (mmol/L)-1·s-1和(48.69±13.79) (mmol/L)-1·s-1,改进型渗透休克法提取的SCPEP在pH6.0和pH 7.0下的活性比高压均质法提取的SCPEP高2.30和1.15倍,故改进型渗透休克法有利于提取的SCPEP保持更高的活性.