沉默RICTOR基因表达提高食管鳞癌细胞对依维莫司的敏感性

目的:探讨沉默雷帕霉素不敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白伴侣(rapamycin insensitive companion of mammalian target of rapamycin, RICTOR)基因表达后食管鳞癌细胞对依维莫司敏感性的变化,及其可能的分子机制.方法:蛋白质印迹法检测食管鳞癌ECa109、EC9706、TE1、KYSE450和KYSE790细胞中RICTOR蛋白的表达情况.采用脂质体转染法将携带有RICTOR-shRNA和Control-shRNA (对照组)的重组质粒分别转入ECa109细胞中,并筛选稳定转染的细胞株(命名为ECa109-RICTOR-shRNA和 ECa109-control-shRNA) .采用 CCK-8法检测沉默 RICTOR基因表达后依维莫司对ECa109细胞增殖的影响,再用蛋白质印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶 B (protein kinase B,PKB,又称Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路中相关因子 RICTOR、Akt、磷酸化 Akt (phospho-Akt, p-Akt) (Ser473)、核糖体蛋白 S6激酶70kDa 肽(ribosome protein subunit 6 kinase of 70 kDa, p70S6K)、p-p70S6K、40 kDa 富含脯氨酸的Akt 底物(proline-rich Akt substrate of 40 kDa,PRAS40)和p-PRAS40 (Thr246)蛋白的表达水平.最后,用ECa109-RICTOR-shRNA和 ECa109-control-shRNA细胞建立裸鼠移植瘤模型,并用依维莫司进行治疗,观察依维莫司对裸鼠体内移植瘤生长的影响.结果:RICTOR蛋白在5株食管鳞癌细胞中均有表达,且在ECa109细胞中表达水平相对较高.与ECa109-control-shRNA细胞相比,ECa109-RICTOR-shRNA细胞的增殖速度明显变慢(P＜0.05);依维莫司对 ECa109-RICTOR-shRNA和 ECa109-control-shRNA细胞的增殖均有明显抑制作用,依维莫司对 ECa109-RICTOR-shRNA和 ECa109-control-shRNA细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值分别为(17.68±1.25) μmol/L和(36.84±1.57) μmol/L.沉默 RICTOR基因表达后,ECa109细胞中 p-Akt(Ser473)和 p-PRAS40(Thr246)蛋白的表达水平明显降低(P值均＜ 0.001),而依维莫司使P-P70S6K蛋白的表达水平下调(P＜ 0.001),但促进了 p-Akt (Ser473)和p-PRAS40 (Thr246)蛋白表达水平的上调(P值均＜ 0.001);与ECal09-control-shRNA +依维莫司组相比,ECa109-RICTOR-shRNA +依维莫司组细胞中p-Akt (Ser473)和p-PRAS40 (Thr246)蛋白的表达水平明显降低(P值均＜0.001),p-p70S6K蛋白的表达水平无明显变化(P＞ 0.05),提示 RICTOR-shRNA能够抑制依维莫司引起的Akt和PRAS40蛋白的磷酸化激活.RICTOR-shRNA和依维莫司均能抑制裸鼠体内ECa109细胞移植瘤的生长(P值均＜0.05),并以RICTOR-shRNA联合依维莫司对肿瘤生长的抑制作用最强(P＜ 0.001).结论:沉默RICTOR基因表达能够提高ECa109细胞对依维莫司的敏感性,其分子机制可能与下调 RICTOR表达抑制了依维莫司引起的Akt和PRAS40的磷酸化有关.