真核表达ZIKA病毒全基因组感染性克隆的建立

目的 构建含有ZIKA病毒全基因组的载体,在真核细胞中产生具有复制能力的ZIKA病毒. 方法 将ZIKA病毒全长基因组序列、CMV启动子、内含子、HDV核酶、SV40终止子序列利用PCR的方法进行拼接,应用重组技术将ZIKA全基因组序列克隆至细菌人工染色体载体pBAC11中,产生重组子pBAC-ZIKAi.将pBAC-ZIKA转染293T细胞中进行ZIKA病毒拯救,7d将上清用0.45 μm滤膜滤过后(ZIKA病毒P0代)感染Vero细胞(产生ZIKA病毒P1代),依此进行传代培养.应用荧光定量PCR、TCID50、噬斑实验等技术检测ZIKA拯救病毒的复制能力、致病力与野生病毒的差别. 结果 含有内含子的ZIKA全基因组序列的感染性克隆转染293T细胞后产生具有复制能力的病毒,并且在第5代病毒仍稳定存在引入的G3128A鉴定标记.分别用拯救病毒与野生病毒感染Vero细胞,用荧光定量PCR检测细胞内病毒RNA,显示拯救病毒的复制能力与野生病毒无明显差别.TCID50检测上清中的病毒滴度也相似.噬斑试验中比对两种病毒形成的噬斑均为大小一致、均匀的圆形,提示两者致病性一致. 结论 通过真核表达系统构建的全长ZIKA病毒基因组感染克隆具有复制能力,为ZIKA病毒的反向遗传学研究提供了理论基础.