致凋亡的声动力疗法诱导巨噬细胞线粒体钙升高的机制研究

目的:研究致凋亡的声动力疗法诱导巨噬细胞线粒体钙升高的机制.方法:应用佛波酯(PMA)诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞进行实验研究.选用5-氨基酮戊酸(ALA)作为声敏剂,进行声动力治疗(SDT).应用流式细胞术证实SDT显著促进了细胞凋亡;应用Rhod 2/AM实时监测线粒体Ca2+水平;通过蛋白质免疫印迹对全细胞蛋白中的Bax、Cleaved-caspase3、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)和三磷酸肌醇Ⅲ型受体(IP3R-Ⅲ)进行检测;应用VDAC1抗体进行免疫共沉淀,检测VDAC1和IP3R-Ⅲ之间的相互作用;实时监测线粒体Ca2+水平,检测VDAC抑制剂DIDS和IP3Rs抑制剂2-ABP对SDT效果的影响.结果:与对照组相比,仅SDT组出现了显著的细胞凋亡(P＜0.001).与对照组相比,ALA对线粒体Ca2+水平无明显影响,超声诱导了线粒体Ca2+水平的明显升高,SDT诱导了线粒体Ca2+水平快速且大幅度的升高,且去除超声后仍维持在较高水平.与对照组相比,超声对Bax、Cleaved-caspase3、VDAC1和IP3R-Ⅲ的表达无明显影响,ALA诱导了VDAC1(P＜0.01)和IP3R-Ⅲ表达量的增加(P＜0.05),SDT诱导了Bax(P＜0.001)、Cleaved-caspase3 (P＜0.001)、VDAC1(P＜0.01)和IP3R-Ⅲ(P＜0.05)表达量的增加,VDAC1和IP3R-Ⅲ的增加幅度与ALA组接近;ALA和SDT均诱导了VDAC1和IP3R-Ⅲ之间相互作用的显著增强(P＜0.05).DIDS和2-ABP均明显抑制了SDT诱导的线粒体Ca2+增加.结论:在致凋亡的SDT作用于THP-1巨噬细胞的过程中,ALA诱导了线粒体外膜Ca2+转运通道VDAC1和内质网重要Ca2+转运通道IP3R-Ⅲ的表达量增加与二者间相互作用的增强,在内质网和线粒体之间建立了大量的Ca2+转运通道,超声的作用则在于触发这些Ca2+转运通道的开放,进而引发线粒体钙的迅速增加.这是后续线粒体凋亡通路启动的重要机制之一.