重组酶聚合酶扩增技术快速检测日本血吸虫核酸方法的建立

目的 应用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,建立一种敏感、特异、简便且快速的日本血吸虫核酸检测方法. 方法 选择Sj28S核糖体基因片段为靶序列,用Primer Premier 5软件设计特异性引物,建立RPA扩增反应,并进行优化以确定最佳反应条件.提取不同虫期日本血吸虫,以及曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片形吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫等基因组DNA,评价所建立方法的特异性和敏感性,并对不同混合比例(1∶10、1∶50、1∶100、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000)的阳性和阴性钉螺基因组DNA的检出性能和重复性进行评价. 结果 建立的RPA方法可特异地扩增出日本血吸虫216 bp大小的目的基因片段.RPA的最佳反应条件为39℃、20 min.该方法与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片形吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫及阴性钉螺基因组DNA均无交叉反应.针对日本血吸虫成虫基因组的最低检出限为100 fg/μl,针对重组质粒的最低检出限为100拷贝/μl,且血吸虫不同虫期的基因组DNA样本均能被准确检出.应用建立的RPA方法检测不同混合比例钉螺DNA混合样品,结果显示,最低检出比例为1:1000.重复性试验结果显示,5次检测结果完全一致,无假阴性和假阳性. 结论 建立了日本血吸虫RPA检测方法,该法敏感性高、特异性好、简便快速,有望用于血吸虫感染的快速检测及风险监测.