滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达.方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基因相对表达量,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白.结果:PpUGT1和PpUGT7分别长1 827 bp和1 380 bp,分别编码608和459个氨基酸,相对分子质量分别为67.6 kDa和51.3 kDa,其中PpUGT1预测为甾体类糖基转移酶,PpUGT7预测为三萜类糖基转移酶.两蛋白均为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,均与同类蛋白具有较高的保守性.实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果显示,PpUGT1的表达量由高到低依次为根＞叶＞花＞茎,PpUGT7的表达量由高到低依次为茎＞叶＞花＞根.此外,成功在大肠埃希菌中以可溶形式表达目的蛋白.结论:克隆得到PpUGT1和PpUGT7基因,证明其在不同植物器官中存在差异表达,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步鉴定PpUGTs功能、解析滇重楼中皂苷类成分生物合成途径奠定基础.