CHO细胞Kcmf1基因内定点整合ZsGreen1报告基因的表达稳定性研究

以Kcf1基因NW 003614172.1第629890碱基处定点整合ZsGreen1报告基因的CHO-K1细胞(2C3)为研究材料,采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪定量分析ZsGreen1的表达,开展系统的稳定性表达研究.2C3细胞贴壁培养连续传代50代次,100％的细胞可以稳定表达ZsGreen1报告基因.无血清悬浮驯化培养2C3细胞后,细胞表达ZsGreen1的平均荧光强度明显降低;连续悬浮传代培养60代次,表达ZsGreen1的细胞数目显著增多,添加体积分数10％ FBS到悬浮培养的细胞池,ZsGreen1阳性细胞比例上升到95％以上.流式细胞术分选细胞池中高、低表达ZsGreen1蛋白的2C3细胞,PCR确认它们均含有Zs Gree n1报告基因;Q-PCR发现在高、低表达ZsGreen1蛋白的细胞中,相关的ZsGreen1 mRNA水平有明显的差异.提示CHO-K1细胞Kcmf1基因内非编码区域定点整合外源基因后,不会因细胞分裂和生长而丢失外源表达基因;悬浮驯化需要优化培养基和培育条件,达到构建工程细胞的需求.