Comparison of different technologies for producing recombinant adeno-associated virus on a laboratory scale

Векторы на основе аденоассоциированного вируса являются одними из наиболее перспективных для доставки трансгенов в различные органы и ткани. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) способен трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, обладает низкой иммуногенностью и способен обеспечивать долгосрочную экспрессию трансгенов. На сегодняшний день существуют технологии, позволяющие получать rAAV для применения in vivo, однако они не лишены недостатков, связанных с трудоемкостью, сложностями масштабирования и высокой стоимостью, поэтому вопрос об усовершенствовании технологических схем получения rAAV является актуальным. Цель работы: сравнение технологических подходов к получению rAAV, основанных на различных условиях культивирования трансфицированной клеточной линии HEK293 в лабораторном масштабе. Материалы и методы: в исследовании использовали культуру клеток HEK293, плазмидную систему AAV-DJ Packaging System, систему PlasmidSelect Xtra Starter Kit. В качестве модели для сравнения технологий использовали вектор rAAV с трансгеном однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1, специфичного к ботулотоксину. Применяли метод трансфекции клеток HEK293 суперскрученной плазмидной ДНК, выделенной при помощи трехступенчатой хроматографической очистки. Определение подлинности препарата rAAV проводили методами электрофореза, иммуноблоттинга и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Результаты: продемонстрирована эффективность получения суперскрученной формы плазмидной ДНК, применимой для эффективной трансфекции с целью получения rAAV. Проведено сравнение процесса транзиентной трансфекции и культивирования трансфицированных клеток HEK293 в условиях суспензии в колбах, адгезии в культуральных флаконах и адгезии в биореакторе BioBLU 5p на матрице из дисков Fibra-Cel с целью продукции rAAV. Выводы: показана возможность применения описанных подходов к очистке плазмидной ДНК, трансфекции и культивированию трансфицированных клеток в различных условиях для получения препарата rAAV, эспрессирующего ген антитела. Реактор BioBLU 5p с дисками Fibra-Cel был впервые использован для получения препаративных количеств rAAV в лабораторном масштабе, что позволило увеличить площадь поверхности адгезии при культивировании и трансфекции клеток и, как следствие, увеличить выход целевого продукта. Ключевые слова: аденоассоциированный вирусный вектор; однодоменные антитела; трансфекция; аффинная хроматография; культура клеток HEK293; биореактор; суперскрученная форма плазмидной ДНК