草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗体制备

[目的]克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料.[方法]提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列.将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY?-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY?-Blunt E1-Brachyury,并进行Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定.将原核表达载体导入RosettagamiB(DE3)大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化.利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA(iELISA)法测定血清多克隆抗体效价.以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平.[结果]克隆了 1 335bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY?-Blunt E1-Brachyury,表达获得了 49.16 ku的重组Brachyury蛋白.成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白.草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高.[结论]成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白.