BDNF和NT-3慢病毒载体构建与相对表达水平比较

目的 构建携带脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、融合基因(BDNF-T2A-NT-3)的慢病毒载体,通过感染人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)检测BDNF和NT-3的mRNA和蛋白相对表达水平.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增制备BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3目的基因片段,离体构建携带BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3的慢病毒表达载体并感染293T细胞;采用PCR技术检测293T细胞中BDNF、NT-3和BDNF-T2A-NT-3 mRNA相对表达水平;采用流式细胞术检测hBMSCs免疫表型;将对数生长期的hBMSCs随机分为hBMSCs组、空载慢病毒组、BDNF组、NT-3组和融合基因组,分别用空载慢病毒、BDNF慢病毒载体、NT-3慢病毒载体、BDNF-T2A-NT-3慢病毒载体感染后,于倒置相差显微镜下观察细胞荧光强度;采用荧光PCR法和蛋白免疫印迹法检测BDNF、NT-3的mRNA和蛋白的相对表达水平.结果 测序分析鉴定结果显示,成功构建了携带BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3的慢病毒载体.慢病毒感染293T细胞后在倒置相差显微镜可观察到绿色荧光,感染目的基因组293T细胞的BDNF、NT-3和BDNF-T2A-NT-3 mRNA相对表达水平均高于无感染目的基因组(P值均＜0.01).流式细胞术检测结果显示,hBMSCs中分化抗原(CD)73+、CD90+、CD34+阳性表达率分别为97.77％、52.15％和0.07％.BDNF组、NT-3组hBMSCs细胞的BDNF mRNA的相对表达水平均高于hBMSCs组(P值均＜0.01),融合基因组hBMSCs细胞的BDNF、NT-3 mRNA的相对表达水平均分别高于hBMSCs组、空载慢病毒组、BDNF组和NT-3组(P值均＜0.01);BDNF组、NT-3组、融合基因组hBMSCs细胞的NT-3蛋白相对表达水平均分别高于hBMSCs组和空载慢病毒组(P值均＜0.01).结论 成功构建的BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3慢病毒载体可介导BDNF和NT-3在hBMSCs中稳定表达,为探索BDNF和NT-3基因在神经退行性疾病发病机制中的作用提供依据.