流感疫苗神经氨酸酶活性荧光底物检测法的建立及验证

目的 建立用于检测流感疫苗神经氨酸酶(neuraminidase,NA)活性的荧光底物法,并进行验证.方法 以唾液酸类似物4-MUNANA作为酶底物,通过测定NA催化底物分解后产物的荧光强度来评价NA活性.选取基于MDCK细胞制备的四价流感疫苗各单价原液(H1N1、H3N2、BV和BY)作为样品,优化荧光底物法的底物酶浓度(10、20、30、40、50 μmol/L)、作用时间(每 2 min 检测 1 次,至 90 min)、缓冲液 pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 和 9.5)及反应温度(4、25、37和45℃).以已知活性的重组NA蛋白作为参考品,验证方法的线性范围、准确度及精密度.用优化的方法检测流感疫苗生产过程中的样品(基于MDCK细胞制备的H1N1、H3N2、BV、BY相应的病毒收获液、纯化液和原液)及以MDCK细胞基质和鸡胚基质制备的四价流感裂解疫苗成品各1批.结果 最佳反应条件为:酶底物浓度20μmol/L,反应时间40 min,pH 7.5,反应温度37℃.重组NA蛋白参考品浓度在62.5～2 000 U/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,R2＞0.99;1 600、800、400 U/L 3个浓度参考品的回收率分别为92.60％～106.96％、85.54％～113.11％、87.00％～114.54％,于 2 个时间点共 12 次检测结果的 CV 分别为 6.40％、8.25％、6.92％.H1N1、H3N2、BV 和 BY 4种亚型的流感疫苗半成品在不同阶段NA活性逐渐降低;细胞基质及鸡胚基质四价流感裂解疫苗成品的NA活性分别为61 585.82和69 583.51 U/L.结论 成功建立并优化了一种NA活性的荧光底物检测方法,该方法具有良好的准确度和精密度,可应用于流感疫苗生产过程及成品中NA活性的检测.