木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取乳鼠原代皮层神经元及鉴定

目的 采用木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取24 h内新生SD大鼠皮层神经元,改进体外原代培养方法.方法 取24 h内新生SD大鼠,剥离脑血管膜分离出大脑皮层,采用木瓜蛋白酶和DNA酶顺序消化、纯化后,以含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基为神经元接种液,4 h后更换为预热的含有B27的Neurobasal-A神经元培养液,连续培养7 d.分别以1×105、5×105、1×106细胞/mL接种于L-多聚赖氨酸浸泡后的6孔板内,并在显微镜下观察细胞的生长状态.取培养7 d后的神经元,采用β-Tubulin免疫荧光法和神经元特异性核蛋白(Neun)抗体免疫组化法鉴定神经元,神经元微管相关蛋白2抗体(MAP2)免疫荧光法鉴定神经元纯度.结果 神经元以密度为5×105细胞/mL接种最为合适,接种24 h后,皮层神经元部分贴壁;接种3 d后,贴壁细胞逐渐增多,神经元突触进一步生长并延长,交联成稀疏网络;接种7 d后,神经元仍大量生长,胞体丰满,并形成更为紧密的神经元网络系统.经β-Tubulin免疫荧光法和Neun抗体免疫组化法鉴定,提取培养细胞为神经元,并经神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定神经元纯度为(91.06±1.51)％.结论 采用24 h内新生SD大鼠分离大脑皮层,经木瓜酶与DNA酶顺序消化,可提取到优质皮层神经元.