山羊支原体山羊肺炎亚种可视化实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速简便、灵敏度高、特异性强的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)核酸快速检测方法,选择Mccp的92.1基因序列为靶序列,设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,并向反应体系中添加可视化染料羟基溴酚蓝(HNB)或荧光染料(Eva green),分别建立Mccp可视化环介导恒温扩增(V-LAMP)和实时荧光环介导恒温扩增(RF-LAMP)检测方法,并对比两种方法的敏感性、特异性、重复性以及两种方法在山羊组织样品中的检测效果.结果显示,两种方法均可检出1.0×10copies/μL的核酸标准品,灵敏度高;与其他支原体及细菌,如丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌等类症病原体,均无交叉反应;V-LAMP、RF-LAMP的变异系数均小于1％;对人工感染的试验样品和临床样品进行检测,两种检测方法结果一致,阳性率为9.09％,并且与实时定量PCR检测结果一致.本试验建立的V-LAMP和RF-LAMP为Mccp流行病学调查和疾病诊断提供了新的临床快速检测方法.