红螯螯虾卵黄蛋白原N端结构域的生物信息学分析与蛋白的表达鉴定

为研究红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原N端结构域(vitellogenin N domain,VitN)的生物学功能并获得具有免疫特异性的红螯螯虾VitN融合蛋白,试验根据红螯螯虾卵黄蛋白原的mRNA序列(GenBank登录号为AF306784.1)获得VitN mRNA序列(编码第42～585位氨基酸),通过在线分析工具对红螯螯虾VitN进行生物信息学分析,并优化合成红螯螯虾VitN基因序列,构建重组表达质粒pET-28a-VitN,将其转化至大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,对红螯螯虾VitN融合蛋白进行表达、纯化、包涵体复性、Western-blot鉴定和浓度测定.结果表明:编码红螯螯虾VitN的氨基酸共544个,均为常见氨基酸,其中丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸含量较多(占比分别为7.72％、7.72％和7.54％),色氨酸含量最少(仅占0.92％);红螯螯虾VitN的相对分子质量为64 681,理论等电点为8.69,共含有8 540个原子,分子式为C2671H4260N758O818S33,不稳定系数为31.49,脂肪系数为74.56,亲水性平均值为-0.45,亲水氨基酸数量明显多于疏水氨基酸数量;编码红螯螯虾VitN的氨基酸全部位于细胞膜外,不存在跨膜区;红螯螯虾VitN亚细胞定位在细胞外或细胞质内,不含常规信号肽,也不含Ⅰ型信号肽酶;红螯螯虾VitN共有67个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点31个,苏氨酸磷酸化位点23个,酪氨酸磷酸化位点13个;红螯螯虾VitN的二级结构包括α-螺旋、β折叠、延伸链、无规则卷曲;三级结构包含具有脂质结合功能的lv-1n和lv-1c肽链结构,且呈现上下两个较为明显的区域,上半部分为sheet折叠结构富集区域,下半部分为α螺旋结构富集区域;在红螯螯虾第129～153位氨基酸和第396～402位氨基酸处各存在一个二硫键.优化后的红螯螯虾VitN基因片段大小约为1 650 bp;经连接、转化、诱导,获得了大小约为64.7 ku的融合蛋白,其在大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞中的主要表达形式为包涵体;最佳诱导条件为37℃、250 r/min振荡培养至菌液的OD600值达到0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol/L,继续于37℃、250 r/min振荡培养4 h;包涵体用Ni-NTA柱纯化时以50 mmol/L咪唑洗脱液的洗脱效果为最佳;经Western-blot鉴定进一步确定该蛋白为 目的蛋白;纯化的红螯螯虾VitN融合蛋白的最终浓度为0.45 mg/mL.说明初步对红螯螯虾VitN进行了生物信息学分析,并成功构建了重组表达质粒pET-28a-VitN,优化了表达系统及纯化方案,获得了具有免疫特异性的红螯螯虾VitN融合蛋白.