大口黑鲈虹彩病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)荧光定量PCR检测方法,本研究基于LMBV的主要衣壳蛋白(MCP)基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过反应条件的优化,建立了 LMBV的TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果显示,该方法以pMD-LMBV-MCP重组质粒为标准品,建立的标准曲线在4.6×102拷贝/μL～4.6×108拷贝/μL浓度范围内与Ct值具有良好的线性关系,相关系数(R2)为1,扩增效率(E)为99.2％.利用本实验建立的方法对传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈弹状病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、草鱼呼肠弧病毒、传染性造血器官坏死病毒及LMBV进行检测,结果显示,该方法仅对LMBV产生特异性扩增,其他病原均为阴性,特异性强;该方法对重组质粒标准品的检测下限为46拷贝/pL,是常规PCR检测方法(4.6×103拷贝/μL)的100倍,敏感性高;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2.5％,重复性好.利用该方法对30份临床样品进行检测,结果显示LMBV阳性率为40％,显著高于常规PCR的13.3％;另外利用该方法对人工感染LMBV的大口黑鲈各组织进行病毒载量测定,结果显示其胃、肝、肠、脾和心脏的病毒载量高于其他组织.本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于临床LMBV的检测和流行病学调查,为LMBV感染的早期诊断提供可靠的检测方法.