轮状病毒NSP4 86-175蛋白对大鼠心肌细胞损伤作用及相关机制研究

目的:研究轮状病毒非结构蛋白4的86~175位氨基酸肽段(NSP4 86-175)对大鼠心肌细胞损伤作用及其相关机制。 方法:利用前期制备好的活性NSP4 86-175蛋白处理大鼠H9C2心肌细胞，观察处理后的细胞生长形态变化，检测细胞培养液中LDH活性；Fluo-3AM标记细胞内游离的钙离子，蛋白质处理细胞后，用激光共聚焦显微镜检测大鼠心肌细胞内钙离子浓度变化。流式细胞术分析蛋白质对细胞凋亡的影响，RT-PCR检测Bax、Bcl-2、caspase-3、78 kDa葡萄糖调控蛋白(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12 mRNA转录水平；Western blot检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达水平。 结果:正常生长的心肌细胞呈典型的成肌样细胞形态，细胞呈梭形，边界清晰。纯化的NSP4 86-175蛋白刺激后出现明显的细胞病变效应，细胞空泡变性，皱缩变圆，细胞碎裂；蛋白质处理组细胞培养液中的LDH活性均增高；与对照组相比，NSP4 86-175处理组细胞的钙离子荧光增强，细胞凋亡率增高，细胞凋亡因子caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax-2表达上调，内质网应激(ERS)经典标志分子GRP78、CHOP和caspase-12表达上调。 结论:NSP4 86-175对大鼠心肌细胞具有损伤作用，这可能与它导致细胞内钙超载，并引起内质网应激进而诱导心肌细胞凋亡坏死有关，为轮状病毒肠道外播散感染和致心肌损伤提供了一定的理论依据。