Ankfy1与Sacsin相互作用参与常染色体隐性痉挛性共济失调(ARSA)致病机制的研究

目的 探讨体外研究Ankfy1(Ankyrin repeat and FYVE domain containing 1)基因敲低后细胞内Sacsin molecular chaperone(SACS)基因的表达水平变化及体内研究条件性敲除小鼠小脑浦肯野细胞内Ankfy基因后SACS基因表达水平变化,确定Ankfy1与Sacsin蛋白相互作用关系在常染色体隐性痉挛性共济失调疾病中的发病机制.方法 体外培养人胶质母细胞瘤细胞A172细胞和人胚肾细胞293T细胞,随机分为对照组和短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)干扰Ankfy1组,即shRNA-Ankfy1组;对照组加入空载慢病毒,shRNA-Ankfy1组加入敲低Ankfy1的慢病毒,使用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantita-tive polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测细胞内SACS的信使核糖核酸(Messenger RNA,mRNA)水平,使用免疫荧光检测Sacsin在细胞内的分布和荧光密度;使Cre重组酶(Cre recombinase)切除Flox(Locus of X-over P1)位点间的靶向基因的技术(Cre-Flox系统)条件性敲除C57BL/6J小鼠的小脑浦肯野细胞内Ankfy1,将此小鼠作为条件性敲除CKO(Conditional gene knoctout)组,同窝未敲除Ankfy1小鼠作为对照组,使用RT-qPCR法检测小鼠小脑内SACS的mRNA水平,使用免疫荧光检测小脑内Sacsin的荧光密度.结果 体外细胞实验发现,与对照组比较,shRNA-Ankfy1组内SACS的mRNA表达水平增高(P<0.05),Sacsin蛋白平均荧光强度增加(P<0.05),且在细胞内分布不均,出现聚集;体内小鼠实验得出,与对照组小鼠比较,CKO组小鼠小脑SACS的mRNA表达水平增高(P<0.05),Sacsin在小脑颗粒层和浦肯野细胞层荧光强度增加,在分子层内出现聚集.结论 Ankfy1下调可能导致Sacsin运输障碍,进而导致其在细胞内出现聚集和代偿性增加,推测Ankfy1引起小脑性共济失调的可能机制是阻断Sacsin的运输,同时也表明常染色体隐性遗传性共济失调的异质性,各致病基因之间可能具有复杂的网络关系.