BMP4在牦牛和犏牛睾丸组织及支持细胞中的差异表达分析

[目的]从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞,检测骨形态发生蛋白4基因(BMP4)及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况,为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础.[方法]采集12月龄耗牛和犏牛睾丸组织,使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA,利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因(骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B))的mRNA表达水平.通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液,经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化耗牛和犒牛睾丸支持细胞.采用HE染色、油红O 染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平.采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在耗牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况.[结果]HE染色结果显示,第3代(F3)支持细胞呈长条形或梭形.油红0染色结果显示,体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累,且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构.ALP染色结果显示,细胞不着色.免疫荧光染色结果显示,支持细胞标志蛋白GATA结合蛋白4(GATA4)呈阳性表达.RT-PCR检测结果显示,支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因(SOX9)、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS)和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达,而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达,间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11Al)则有少量表达.BMP4在耗牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达,且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞,而其受体基因ALK6、BM-PR2、ACVR2A和ACVR2B在耗牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞.[结论]从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞,BMP4在耗牛支持细胞中表达量较高,暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用.