基于DNA甲基化测序技术研究青蒿琥酯干预脑胶质瘤的分子机制

目的 探究青蒿琥酯干预胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的药效及其潜在分子机制.方法 采用Cell Titer-Blue 检测青蒿琥酯对U87和U251 2种人源胶质母细胞瘤细胞活性和增殖的影响;流式细胞术检测青蒿琥酯对2种细胞周期的调节作用;采用qRT-PCR和Western blotting检测青蒿琥酯对2种细胞自噬水平的影响.采用DNA甲基化联合网络药理学从表观遗传学层面研究青蒿琥酯干预GBM的靶标基因,并建立蛋白质-蛋白质相互作用网络,通过计算网络中各节点的网络拓扑特征值,筛选出青蒿琥酯干预GBM的核心靶点并进行生物功能富集分析;采用AutoDock v4.2.6和AutoDock Vina v1.2.0软件开展分子对接虚拟计算,考察青蒿琥酯与其候选关键靶点的结合能力,并采用Western blotting验证青蒿琥酯对2种脑胶质瘤细胞中关键靶点表达的影响.结果 青蒿琥酯可显著抑制U87细胞的活性和增殖(P＜0.05、0.01、0.001),而对U251细胞的药效不显著;高剂量青蒿琥酯可影响2种细胞周期分布;高剂量青蒿琥酯可显著提高U87细胞中3种自噬标志分子[自噬关键分子酵母 Atg6 同系物(ATG6 autophagy related 6 homolog,Beclin1)、泛素结合蛋白(ubiquitin-binding protein,p 62)、微管相关蛋白 1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)]的mRNA 表达水平(P＜0.001),而仅高剂量青蒿琥酯升高U251细胞中p62的mRNA表达水平(P＜0.05);低、中、高剂量青蒿琥酯可显著提高U87细胞中Beclin1、p62、LC3B蛋白表达水平(P＜0.05、0.01),仅中、高剂量青蒿琥酯可以影响U251细胞中Beclin1、p62、LC3B蛋白表达.利用给药前后的U87与U251细胞进行DNA甲基化测序与网络药理学整合分析,在获得青蒿琥酯敏感型和耐药型脑胶质瘤细胞的差异基因集,以及青蒿琥酯干预2种细胞效应基因集的基础上,发现其干预2类脑胶质瘤细胞的关键网络靶标共同参与GBM恶性进展密切相关的血小板衍生生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor α,PDGFRA)-大鼠肉瘤基因(rat sarcoma viral oncogene homolog,RAS)-B-Raf 原癌基因(B-Rafproto-oncogene,BRAF)-丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)-细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)通路,且青蒿琥酯与其直接靶标(PDGFRA、BRAF)具有较强的亲和力.Western blotting实验证实青蒿琥酯可以抑制U87和U251细胞中关键靶点PDGFRA和BRAF蛋白的表达(P＜0.05、0.01、0.001).结论 青蒿琥酯可能通过靶向调控PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK信号通路,从而抑制GBM细胞的生长和扩散,为青蒿琥酯治疗GBM提供了体外实验依据,也为解决临床抗肿瘤药物的耐药问题提供了新思路和新方法.