重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌

目的 重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7 4种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a.方法 设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性.结果 RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测.检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7的最低检测限为10copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应.应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000).结论 RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测.