基于VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨木犀草素干预A型流感病毒的作用机制

目的 探讨木犀草素对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染的小鼠肺上皮细胞损伤模型的作用机制.方法 将小鼠肺上皮MLE-12细胞分为正常组、模型组、奥司他韦组、高剂量组和低剂量组,除正常组外,其余4组均使用IAV感染,正常组加入等量病毒稀释液;2h后弃病毒工作液,正常组和模型组加入病毒维持液,药物组加入用病毒维持液稀释的药物工作液,干预8h后收集细胞.使用CCK-8检测细胞增殖情况;ELISA实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光检测细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测细胞内VEGF、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达情况;Western blot法检测细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS蛋白表达情况.结果 CCK-8结果显示,不同浓度的木犀草素均能降低IAV感染所致的细胞损伤(P＜0.01),其EC50 值为7.204 μmol/L,因此,将后续实验中的木犀草素药物浓度定为5 μmol/L和 2.5 μmol/L.与正常组相比,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-6升高(P＜0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度增强(P＜0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达升高(P＜0.01);与模型组相比,高剂量组和低剂量组细胞上清液中TNF-α和IL-6降低(P＜0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度减弱(P＜0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达降低(P＜0.01).结论 木犀草素能抑制炎性细胞因子的分泌,缓解IAV感染所致的细胞损伤,其过程可能与VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关.