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Analytical Chemistry | 使用强发射铜纳米标签从纳克输入中高灵敏度荧光检测全局5-羟甲基胞嘧啶

作者: 张崇敬课题组

时间: 2021-10-26 17:42

使用强发射铜纳米标签从纳克输入中高灵敏度荧光检测全局5-羟甲基胞嘧啶


文献来源:Analytical Chemistry

文献题目:Highly Sensitive Fluorescence Detection of Global 5‑Hydroxymethylcytosine from Nanogram Input with Strongly Emitting Copper Nanotags

文献作者信息:通讯作者为山大学生物医学工程学院广东省传感技术与生物医学仪器重点实验室的戴宗教授

研究背景


近年来,5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)作为5-甲基胞嘧啶(5mC)脱甲基的中间产物,在10-11易位(TET)双加氧酶被称为“第六碱基”,受到越来越多的关注。由于在脑、乳腺、肝、肺、肾等肿瘤中观察到5hmC广泛缺失,5hmC现在被认为是多种癌症的潜在生物标记物。因此,5hmC的定量分析对早期癌症诊断具有显著的临床意义。目前,液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术、亚硫酸氢盐测序和基于抗体的免疫分析是5hmC检测和定量的主要方法。然而,由于5hmC的丰度较低(低于胞嘧啶的1%)以及亚硫酸氢盐会诱导DNA降解,因此这些方法需要大量的起始材料,限制了它们在稀有样品中的应用。在过去的几年里,人们已经构建了多种电化学生物传感器,使用具有灵敏度、选择性和节省时间的方法,通过低输入DNA(10-100 ng),来检测5hmC或其他核酸的表观遗传修饰。在这些方法中,最敏感的生物平台涉及一种下拉技术,使用特定的5hmC抗体或与可沉淀基质偶联的酶在全基因组范围内富集羟甲基化DNA序列。这些生物传感方法适用于全局或基因特异性5hmC的快速有效评估,使其更有可能满足临床诊断的需求,并具有多重和定点检测功能,然而,所涉及的基于抗体的免疫沉淀方法通常显示CpG密度相关的偏差和下拉的潜在污染物。化学或化学酶法已被很好地开发用于用点击标签选择性和共价标记5hmC,以更少的DNA起始材料提供5hmC的准确和灵敏定量。在这些方法中,叠氮化物修饰的葡萄糖部分通过T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶(β-GT)从尿苷二磷酸-6-叠氮化物葡萄糖(UDP-N3-Glu)转移到5hmC的羟基,形成6-N3-β-葡萄糖基-5hmC(N3-5gmC)。通过无铜点击化学,N3-5gmC的叠氮化物基团与生物素、荧光、甚至DNA寡核苷酸的炔烃修饰标签相连,与基于抗体的方法相比,5hmC的标记更加全面和准确。与5hmC的单分子标记相比,含有大量信号的“超级标签”更有可能实现常规仪器对低丰度5hmC的检测。作者们最近报道了一种战略使用铜(Cu)基金属-有机框架(MOF)作为“超级标签”,可实现15000倍的信号放大,并通过电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)灵敏地检测5hmC。然而,MOF非特异性吸附产生的不可避免的背景噪声将样本输入增加到近1μg基因组DNA。为了解决这个问题,作者们认为有两个关键因素可以确保高信噪比:(1)在一个5hmC位点标记尽可能多的标签;(2)最小化背景信号。考虑到直接聚合酶催化扩增附着在5hmC上的DNA寡核苷酸可以显著减少起始物质,一种新的想法是在这些聚合产物的一个5hmC位点上修饰许多荧光标记。与其他DNA聚合酶相比,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)具有模板自由和序列独立的特点,可以有效催化2'-脱氧胸腺嘧啶-5'-三磷酸(dTTP)的加成反应,将末端的数千个胸腺嘧啶(T)添加到DNA的3'-OH端。每条尾巴可以形成大量的荧光铜纳米颗粒(CuNPs)。此外,如果非靶DNA的3'-OH端被完全阻断,则可以获得极低的非特异性背景。因此,将非靶标DNA阻断、选择性5hmC标记、附着寡核苷酸的无模板延伸和多个荧光标记整合到一个5hmC位点的延伸产物上,将有望在常规临床诊断中实现高灵敏度和高选择性的5hmC定量。在此,作者们提出了一种称为hmC-TACN的高灵敏度荧光方法,用于基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)辅助形成荧光铜(Cu)纳米标签从几个纳克输入进行全局5hmC定量。

主要内容


该方法的程序与原理
基于TdT辅助形成强发射铜纳米标签(称为hmC-TACN)的高效荧光法的程序和原理如方案1所示,(1)阻断基因组DNA片段:基因组DNA片段的3'端被2',3'-二脱氧胸腺嘧啶-5'-三磷酸(ddTTP)利用TdT阻断,以避免TdT催化的非特异性延伸。(2)糖基化:基因组DNA中的5hmC被β-GT和UDP-N3-Glu标记为叠氮化物葡萄糖片段,形成N3-5gmC。(3)点击反应:带有炔基的随机引物二苯并环辛烷(DBCO)通过点击化学共价连接叠氮化物修饰的5hmC位点。详细的分子机理见方案1B。(4)信号扩增:TdT沿着附着在5hmC上的引物发起无模板延伸,生成长聚(T)尾,可作为生成荧光CuNPs的模板。因此,含有大量CuNPs的强荧光标签可以标记在5hmC位点上,导致5hmC信号以类似PCR的方式扩增,而无需复杂的引物设计和热循环。与其他单分子荧光标记方法相比,具有大量铜纳米标签的hmC-TACN即使在样品输入非常低的情况下,也可以通过普通仪器实现5hmC定量,具有很高的性价比,易于掌握,低输入的临床应用前景。Scheme 1. (A) SchematicIllustration of Fluorescence Detection of 5hmC by hmC-TACN Method: (1) Blockingthe Fragmented Genomic DNA, (2) Glucosylation, (3) Click Reaction, and (4) Signal Amplification. (B) Molecular Mechanism of 5hmC Labeled by a RandomPrimer.


随机引物可成功地标记5hmC-DNA,具有高的特异性和标记效率

由于该策略的前提是5hmC位点可以被随机引物特异性、高效地标记。因此,作者们利用含有一个5hmC位点的62-merDNA模型(5hmC-DNA)验证了DBCO修饰引物与叠氮葡萄糖修饰的5hmC-DNA模型的交联性。如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图所示,经过糖基化和点击反应后,在5hmC-DNA反应中观察到分子量较高的交联产物(图1)。相反,在C-DNA、5mC-DNA、5fC-DNA和5caC-DNA模型中未出现任何产物,其中5fC为5-甲酰胞嘧啶,5caC为5-羧基胞嘧啶,表明5hmC标记过程的高度特异性。值得注意的是,5hmC的标记效率相当高,从标记反应后原始5hmC-DNA的可忽略带可以看出,5hmC的标记效率接近100%。这些结果表明,该随机引物成功地标记了5hmC-DNA,具有高的特异性和标记效率。

Fig. 1: PAGE analysis oflabeling products from different DNA models.

荧光铜纳米颗粒(CuNPs)检测灵敏度优于荧光银纳米颗粒(AgNPs)
在这一部分中,作者们首先通过PAGE分析用引物来验证TdT的DNA延伸能力(图2A)。反应30分钟后观察到延伸产物的拖尾带,表明在引物上快速形成聚(T)尾。接下来用该引物合成了聚(T)模板荧光CuNPs,并对其进行了表征。根据之前的报道,合成的荧光CuNPs在345 nm和627 nm处表现出最大激发和发射强度(图2B)。作为另一种广泛报道的TdT辅助方法,多胞嘧啶(C)模板化荧光银纳米颗粒(AgNPs)是通过TdT催化在引物的3'-OH端加入2'-脱氧胞嘧啶-5'-三磷酸(dCTP)合成的。如图2C所示,AgNPs显示出更窄的斯托克斯位移和更强的背景干扰,这将降低检测灵敏度。此外,AgNPs的合成需要24小时,大大增加了分析时间,而CuNPs的形成可以在几分钟内通过更简化和可控的程序完成。除此之外,作者们还进一步研究了不同条件下获得的CuNPs的荧光强度,包括dTTP、Cu2+和抗坏血酸(AA)的浓度,以及TdT催化和CuNPs形成的次数(图2D-H)。在优化的底物浓度下,当延伸反应进行2h,然后CuNPs形成用5min时,获得了最佳条件。


Fig. 2: (A) PAGE image forthe extended product of 2 µM primer by TdT with different incubation times. (B) Excitation (black line) and emission (red line) spectra of poly (T)-templatedfluorescent CuNPs after TdT-mediated extension of 2 µM primer. (C) (C-1) Excitation(black line) and emission (red line) spectra of poly (C)-templated fluorescentAgNPs after TdT-mediated extension of 0.2 µM primer. (C-2) Fluorescence spectraof AgNPs synthesized in the presence and absence of poly (C). (D) Fluorescenceintensity of CuNPs upon different concentrations of dTTP. (E) Fluorescenceintensity of CuNPs upon different concentrations of Cu2+. (F) Fluorescenceintensity of CuNPs upon different concentrations of AA. (G) Fluorescenceintensity of CuNPs upon different extension time. (H) Fluorescence intensity ofCuNPs upon different CuNPs synthesis time.


ddTTP可高效阻断DNA模型的所有3'-OH端
为确保聚(T)尾只在所附引物上延伸,在引物延伸到5hmC-DNA之前,DNA样品中的3 '-OH端应被完全阻断。如图3A所示,在3'-ddT阻断的DNA模型中没有延伸产物,而在未阻断的DNA模型中可以清楚地看到延伸产物。此外,作者们通过合成的CuNPs的荧光强度来评估ddTTP的阻断效率。如图3B所示,未阻断样品中显示出强荧光强度;然而,使用3′-ddT阻断的DNA模型,荧光被大大抑制,这与不含TdT的未阻断DNA模型所产生的荧光接近。这些结果表明,ddTTP几乎阻断了DNA模型的所有3'-OH端,导致非特异性背景最小,信噪比最高。为了进一步消除非特异性延伸,作者们将3'- ddT阻断的5hmC-DNA模型标记后,用凝胶提取试剂盒去除未结合的引物,在随后的TdT辅助下形成CuNPs,通过透射电子显微镜(TEM)对产物进行了表征,显示出直径约为5 nm的单分散CuNPs(图3C)。

Fig. 3: (A) PAGE analysisof extending products from 3′-ddT-blocked and unblocked DNA model. (B) Fluorescenceintensities of CuNPs generated from blocked and unblocked DNA models in thepresence and absence of TdT. (C) TEM image of the poly(T)-templated CuNPs at 5hmC site.


5hmC的分析不会受到结构相似碱基的干扰
在这一部分中,作者们首先用hmC-TACN方法分析了不同纳克(2、5、10 ng)的DNA模型,其中包含不同比例的5hmC-DNA,以确定最小化样本输入量。结果表明,5 ng的样本输入足以给出一个可感知的信号(图4A-C)。在5 ng样品输入的情况下,发射波长为627 nm的荧光强度(I)在0.097% 到0.81% 的范围内随5hmC(A5hmC)量的增加而线性增加(图4D-E)。检测限(LOD)估计为总核苷酸的0.021%(S/N=3),也就是64pM(相当于每50 μL 3.2 fmol)。为了验证分析的选择性,使用相应的DNA模型检查来自C、5mC、5fC和5AC的干扰。如图4F所示,在5hmC-DNA模型中,荧光强度有很大的增加,而相同的hmC-TACN处理后,C-DNA、5mC-DNA、5fC-DNA和5caC-DNA模型的荧光强度接近空白。因此,5hmC的分析不会受到结构相似碱基的干扰,即使这些碱基普遍存在于生物DNA样本中。


Fig. 4: (A-C) Fluorescencespectra of CuNPs with sample input of (A) 2 ng, (B) 5 ng, and (C) 10 ng. (D) Fluorescence responses of the hmC-TACN assay to different 5hmC levels in DNAmodels. (E) Linear plots of fluorescence intensities versus 5hmC levels in DNAmodels. (F) Selectivity of the hmC-TACN assay.


该分析适用于生物样品且对哺乳动物基因组样本中5hmC检测具有良好准确性
受模型试验中良好分析性能的启发,作者们进一步研究了所提出的检测实际样品中全局5hmC的方法的可行性。从富含5hmC的成年小鼠脑中提取的基因组DNA中5hmC水平首先通过标准LC-MS/MS定量为总核苷酸的0.44%,作为后续定量校准的参考。在3′端被阻断后,基因组DNA分为两部分,其中一部分以与5hmC-DNA模型相同的方式用引物标记,并以不同的比例与另一未标记的部分混合,使5hmC样品的水平为0%-0.44%(总输入量为5 ng)。混合物经过TdT辅助形成CuNPs,然后通过荧光分光光度法进行测量。荧光强度在0.044% 到0.44% 的范围内随5hmC含量的增加而线性增加(图5A),LOD估计为0.022%(1.1 pg 5hmC)。值得注意的是,5hmC定量的线性范围涵盖了大多数生物样品中发现的5hmC水平,因此,该分析适用于分析生物样品。

Fig. 5: (A) Linear plots offluorescence intensities versus standard 5hmC levels in genomic DNA. (B) Estimations of 5hmC levels in tissue.


根据以往的研究,哺乳动物基因组中的5hmC水平与年龄有关,随着年龄的增长,5hmC水平不断增加,最终达到一个稳定值,与其他组织相比,5hmC水平在大脑中最为丰富。在本研究中,作者们所提出的方法成功地量化了5 ng基因组DNA中的准确5hmC水平,成年小鼠海马、成年小鼠肾脏和新生小鼠大脑中的准确5hmC水平分别为0.274%、0.093%和0.107%,这与标准LC-MS/MS方法在50 ng输入下测得的结果非常一致(图5B)。因此,该方法可以提供哺乳动物基因组样本中5hmC检测的良好准确性。此外,脑组织和成年鼠中5hmC水平升高的结果与先前的数据一致。该分析适用于人类癌细胞,正常细胞,少量细胞及临床尿液中5hmC的检测
作者们首先用该方法测定了三种人类癌症细胞系中的总5hmC水平,包括人类乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)、人类非小细胞肺癌细胞系(A549细胞)和人类肝细胞癌细胞系(HepG2细胞)以及三种相应的正常细胞系中的总5hmC水平,包括人正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A细胞)、人肺成纤维细胞系(HLF细胞)和人正常肝细胞系(WRL68细胞)。如图6A所示,与正常细胞相比,癌细胞中的5hmC显著下调,这与文献报道一致。接下来为了测试hmC-TACN是否可用于少量细胞样本分析,作者们分别对100个HepG2和WRL68细胞进行了分析。随着TdT催化时间的延长(从2到5小时)和五倍的dTTP浓度,在这两个细胞之间观察到明显的荧光信号(图6B),显示出实现肿瘤模型微区分析的巨大潜力。最后为了进一步评估hmC-TACN在临床应用中的诊断性能,作者们分析了一名膀胱癌患者和健康对照组尿液中5 ng基因组DNA中的全局5hmC。如图6C所示,膀胱癌患者尿液中的5hmC含量明显低于健康对照组,表明hmC-TACN用于无创样本分析的临床潜力。除人类尿液外,血液是重要的临床样本;但其5hmC含量极低,约为0.004%(24 fmol)。考虑到目前该方法的线性范围为6.7至67 fmol(0.044%-0.44%的5ng DNA)覆盖了血液基因组DNA中的5hmC量,因此作者们认为,只要样本输入增加到数百纳克,他们的方法就有可能确定血液样本中的5hmC量。

Fig. 6: (A) Estimations of5hmC levels in cell. (B) Fluorescenceintensities of the hmC-TACN system in response to 100 cells of HepG2 and WRL68under general procedure or condition of prolonged extension time (5 h) andquintuple dTTP concentration. (C) Estimations of 5hmC levels inurine samples.


总结


作者们建立了一种经济高效的hmC-TACN方法,用于在输入数ng基因组DNA的情况下灵敏地检测全局5hmC。与已被报道的一种类似的TdT辅助无模板化学发光策略(hmC-GLIB-IAS,300 ng 基因组DNA输入)相比,作者们的荧光hmC-TACN策略直接放大5hmC位点,DNA输入量为5 ng(∼1000个细胞),在检测极低输入临床样本方面显示出良好的应用前景,且没有电化学生物传感器可能的抗体CpG密度相关偏差或下拉的潜在污染物。通过以更高的反应物浓度进一步延长扩增反应时间,这种hmC-TACN方法可以实现高的灵敏度,以至于可以在普通仪器上分析含有100个细胞的样品。并且作者们成功评估了包括组织、细胞和尿液在内的样本中的全局5hmC水平,结果显示,与正常样本相比,癌症样本中的5hmC水平显著降低。这些研究表明,hmC-TACN有可能在样本有限的情况下促进基于5hmC的癌症或其他疾病的无创诊断,并为肿瘤模型的微区分析提供一个强大的平台。

整理:Chen Chen

原文来源:https://www.aminer.cn/pub/616809b35244ab9dcb310427

[关于转载]:本文转载于张崇敬课题组,仅用于学术分享,有任何问题请与我们联系:report@aminer.cn。

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