目的 探究肠道病毒A71型(enterovirus A71,EV-A71)VP1-E98K突变对人清道夫受体B2敲入(human scavenger receptor class B member 2 knock-in,hSCARB2-KI)小鼠致病性的影响.方法 利用 pSVA-EV-A71-Isehara感染性克隆重组质粒获取拯救的EV-A71 Isehara株,分别在人恶性胚胎横纹肌瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞和转染hSCARB2的RD细胞(RD-hSCARB2)中传代并收获病毒,感染小鼠后建立hSCARB2-KI小鼠感染模型.研究中还采用了感染小鼠的临床评分指标、RT-qPCR、HE染色和免疫荧光技术、ELISA、病毒滴定等方法研究病毒的致病性.结果 用RD细胞中连续传代获得的EV-A71 Isehara株攻击hSCARB2-KI小鼠,未观察到预期的体质量减少、行动迟缓、肢体瘫痪等临床表现;经测序确定该病毒株衣壳蛋白发生了 VP1-E98K突变,故称之为VP1-98K突变株.而野毒型EV-A71 Isehara株(VP1-98E野毒株)感染的hSCARB2-KI小鼠,其大脑、肺脏、骨骼肌组织中病毒载量、组织病理改变、血清中IL-1α、IL-1β、IL-2等水平均高于VP1-98K组,差异具有统计学意义(P＜0.05).细胞学实验发现,经RD细胞传代收获的第5代病毒均检测到VP1-E98K突变,而RD-hSCARB2细胞传代的同代次病毒中则未检测到相应突变,仍为VP1-98E野毒株.结论 VP1-E98K突变显著减弱了 EV-A71对小鼠的致病性.此外,能高表达hSCARB2受体的RD细胞有助于EV-A71 Isehara株的稳定传代增殖,并减少病毒突变机率.
目的 分析碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)T361株的耐药及毒力基因携带情况.方法 肺炎克雷伯菌T361株分离自昆明医科大学第一附属医院干部医疗科患者的痰液标本.采用Vitek-2compact系统对菌株进行鉴定和药物敏感性试验.使用PCR检测菌株的耐药基因.并用Illumina Hiseq 4000高通量测序平台对其进行全基因组测序,分析菌株携带的耐药及毒力基因.结果 肺炎克雷伯菌T361株对头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟诺喹酮类、磺胺类、β内酰胺/β 内酰胺酶抑制剂复合物、呋喃妥英及替加环素等抗生素均耐药.PCR检出blaKPC-2、blaTEM、blaSHV及blaCTX等耐药基因.全基因组测序得到1条完整的基因组序列(GenBank 登录号:CP053016)及 4 条质粒序列(GenBank 登录号:CP053017、CP053018、CP053019、CP053020).在染色体基因组中发现,有44种耐药相关基因,包括blaSHV-11、ompK36、ompC、ompK37、lamB等;有50多种毒力基因,包括fimD、mrkC、mrkD、ybtE、ybtT等.在质粒1(pKPN361-1)中发现了 4种耐药基因,包括blaCTX-M-65、blaTEM-1、rmtB和blaKPC-2;质粒 2(pKPN361-2)中发现了 6 种耐药基因,包括 tet(A)、sul1、mphA、aph(3')-Ia、blaLAP-2和aac(3)-Ⅱd;质粒3(pKPN361-3)和质粒4(pKPN361-4)中未检测到耐药基因,并且4个质粒中均未发现毒力基因.结论 碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌T361株中携带了大量耐药及毒力基因且产酶耐药基因位于质粒上,造成其易传播,临床上须引起高度重视.
铝佐剂(aluminum adjuvant)是人用疫苗生产中应用最广泛的一种佐剂,已使用了近百年.随着研究者对铝佐剂的研究深入,人们对铝佐剂的理化性能、吸附效果、吸附后抗原结构及稳定性变化的了解越来越全面.缓冲溶液、pH、离子强度及其他相关辅料影响铝佐剂对疫苗抗原的吸附作用和吸附后抗原结构的稳定性.这些吸附条件的变化对改进疫苗制剂配方、优化疫苗生产工艺提供重要参考.同时,随着多种新型疫苗的研发,疫苗对佐剂的要求越来越高.新型纳米铝佐剂和复合佐剂因具有较高的免疫增强功能成为铝佐剂研究的新方向.现就目前常用铝佐剂的理化性能、铝佐剂对抗原的吸附作用、吸附对抗原结构稳定性的影响及新型铝佐剂的研究作一概述.
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是临床常见的革兰阴性菌之一,分布广泛且可引起多种感染.PA可分泌大量的毒力因子,包括脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、鼠李糖脂(rhamnolipid)、外毒素A(exotoxin A)、蛋白酶(proteinase)、生物膜(biofilm)和Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)等,且PA毒力机制较复杂.在PA感染过程中,群体感应系统(quorum-sensing,QS)和双组分系统(two-component systems,TCS)扮演着重要的角色,调控PA生物膜的形成和毒力因子的产生.现就PA毒力因子的研究进展及调控机制作一概述.
多糖蛋白结合疫苗相对于多糖疫苗成功的关键是其诱导了对于多糖的免疫记忆,增强了机体对病原菌的免疫应答.而结合物的纯度对结合疫苗的效果起着至关重要的作用.纯化方法的选择对于结合物制备的产率和成本具有重要意义,常用的结合物纯化方法种类多样,目前主要使用的纯化方法基于被分离物所带电荷、溶解度、分子大小进行分离纯化.现就这3类常用的多糖蛋白结合物的纯化方法及应用作一概述,为今后的研究提供参考.
手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒(enterovirus,EV)引起的急性传染病.目前,手足口病已在全球各地出现多次暴发与流行,是一个重要的公共卫生问题,给世界上许多国家带来了严重的经济负担.手足口病的治疗尚无特定的抗病毒药物,主要是对症治疗和支持性治疗.有学者认为,疫苗接种是预防和控制手足口病经济且有效的措施.基于此,现就手足口病病原学特征和相关疫苗作一概述.
埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)同属丝状病毒科,均是传染率和致死率极高的四级烈性病毒,可感染人类及非人灵长类动物等.病毒表面的糖蛋白(glycoprotein,GP)与受体结合、病毒入胞密切相关,是导致病毒致病性最重要的蛋白,在抗体和疫苗的研发中被认为是重要靶点.在EBOV暴发期间已有4种针对GP的抗体(ZMAPP、Regn-EB3、mAb114和MIL77)成功救治了多名感染EBOV的患者,但目前还没有MARV抗体进行过临床试验.现就丝状病毒EBOV和MARV的GP突变及治疗性抗体作一概述.
目的 建立检测4型肺炎球菌多糖侧链上的丙酮酸(pyruvic acid,PA)含量的定量核磁共振(quantitativenu-clear magnetic resonance,qNMR)方法,并进行验证.方法 用以3-(三甲基硅)丙酸-D4钠盐为内标的重水作为溶剂,在600 MHz核磁共振仪上采集波谱,采集参数为:脉冲程序zg30,弛豫延迟时间9 s,扫描次数512次.对方法进行线性、范围、专属性、准确度、精密度、耐用性验证.结果 PA含量在0.10～12.00mg/mL范围内线性良好,且R2＞0.99.以PA上的甲基质子峰(化学位移1.54 ppm)为特征峰测定PA信号峰,qNMR检测方法专属性良好.两种方法的回收率分别在93.52％～101.37％和92.71％～100.10％之间;建立的方法重复性及中间精密度良好,不同PA含量测定值RSD分别为3.67％,2.12％和3.70％;改变温度和扫描次数,2种条件的测定结果差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 建立的4型肺炎球菌多糖中PA含量qNMR检测方法简便、切实有效,为13价肺炎球菌结合疫苗的生产提供了一种可靠的产品放行或过程监测方法.
目的 建立反相高效液相色谱法(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度.方法 利用Agilent AdvanceBio RP-mAb SB-C8(100 mm×2.1 mm)分析柱和Agilent1260高效液相色谱系统,以含0.1％三氟乙酸水溶液-异丙醇(98∶2)为流动相A,以含0.1％三氟乙酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,体积流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为65℃,进样体积为10 μL,采用面积归一法检测CRM197蛋白纯度,并对方法的适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性、灵敏度和耐用性指标进行考察.用建立的方法检测CRM197蛋白酸处理供试品溶液、碱处理供试品溶液及3批原液的纯度.结果 建立的方法系统适用性良好;专属性验证表明空白溶液在目标峰积分范围内无干扰峰,热处理CRM197蛋白目标峰与其他杂质峰分离度＞1.5;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.14％,保留时间RSD为0.81％;中间精密度分析目标峰面积RSD为1.62％,保留时间RSD为0.06％;CRM197蛋白含量在20～2 000 μg/mL范围内,与峰面积存在良好的线性关系(R2=0.999 8);最低检测限为10 μg/mL,定量限为20 μg/mL;在改变柱温色谱条件时,目标峰面积百分比与保留时间均RSD≤5.00％,耐用性研究合格.对酸处理、碱处理供试品溶液及3批原液进行纯度检测,纯度在76.5％～96.9％,结果准确.结论 建立的RP-HPLC检测CRM197蛋白纯度的方法,经验证各项指标均符合要求,可用于CRM197蛋白的纯度检测.
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是副黏病毒科正肺病毒属的非分节段单股负链RNA病毒,给婴儿和老年人造成严重的疾病负担.目前尚无批准上市的预防性疫苗.反向遗传学(reversed genetics)利用DNA重组等技术精确改造基因的结构并且是分子病毒学中最重要的研究工具之一.反向遗传学技术通过构建病毒基因组互补DNA(complementary DNA,cDNA)克隆获得感染性重组病毒,在RSV感染机制研究以及疫苗研发中广泛使用.现结合RSV的基因学特性,对RSV反向遗传构建以及疫苗设计作一概述.
目的 研究灌流培养中,不同的细胞特异性灌流速率(cell specific perfusion rate,CSPR)对狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞生长及抗体蛋白表达的影响,摸索适合本细胞株灌流培养的CSPR.方法 在标号为CSPR 1～5[CSPR1;0.02 nL/(细胞·d)、CSPR2:0.03 nL/(细胞·d)、CSPR3:0.04 nL/(细胞·d)、CSPR4:0.05 nL/(细胞·d)、CSPR5:0.06 nL/(细胞·d),每组3个重复]的15个TPP管中按100万个/mL的初始密度接种相同的CHO种子细胞;摇床中,以转速225 r/min、CO2浓度5.0％、湿度80％和温度37℃的条件培养细胞;以后每天取细胞样品,分别检测活细胞密度(viable cell density,VCD)、细胞活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度和渗透压.接种3 d起,每天分别从CSPR 1～5的各管中,按0.02～0.06 nL/(细胞·d)的CSPR计算所需要更换的细胞悬液体积,将各管中的细胞悬液离心,取出相应体积的上清并补入相同体积的新鲜培养液重悬细胞后,继续培养.如细胞悬液中的葡萄糖质量浓度≤3 g/L时,用300 g/L的葡萄糖补至8 g/L.CHO细胞培养约19 d时,结束实验.根据CHO细胞生长、细胞代谢、抗体蛋白滴度(titer)、收获液总体积和抗体蛋白总收量,确定适合本细胞生长和表达的CSPR.结果 在CSPR 1～2[0.02～0.03 nL/(细胞·d)]的条件下灌流培养时,最高VCD分别为1 059万个/mL、1 298万个/mL,细胞活率在培养中后期下降较快,抗体蛋白总收量分别为98 mg和112 mg.CSPR3～5[0.04～0.06 nL/(细胞·d)]条件下的最高VCD分别为1 422万个/mL、1 523万个/mL和1538万个/mL,细胞活率维持较好,抗体蛋白总收量分别为119 mg、120 mg和107 mg.结论 当CSPR为0.04～0.05 nL/(细胞·d)时,细胞生长和抗体蛋白表达情况较好,为适合本细胞株灌流培养的CSPR.
肉毒毒素(botulinum toxin)是肉毒杆菌(clostridium botulinum)产生的蛋白质,能够抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放,从而达到化学性去神经支配作用.根据这一特性,肉毒毒素被用于治疗多种疾病,并且具有多个美容适应症.肉毒毒素共有7种血清型(A-G),目前仅A、B血清型应用于临床.肉毒毒素作用平均维持3～6个月,患者通常需要接受反复治疗以维持疗效,这也使少数患者不可避免地受到肉毒毒素制剂免疫原性的影响.研究表明,肉毒毒素制剂的免疫原性造成患者出现中和抗体(neutralizing antibodies,NAbs)或继发性无应答(secondary non-re-sponse,SNR)是治疗效果不佳的原因之一.现就肉毒毒素结构、毒素各组分潜在的免疫原性及免疫原性对临床治疗的影响作一概述.
目的 建立B型肉毒毒素(botulinum toxin B,BoNT/B)快速检测方法,研制B型肉毒毒素酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒.方法 以B型肉毒类毒素为抗原免疫小鼠,用杂交瘤技术获得鼠源单克隆抗体(单抗),体内法扩大制备单抗.间接ELISA测定杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性、腹水效价以及单抗的亚型、理化性质和抗原识别表位.过碘酸钠法对抗原表位差异较大的抗体进行HRP标记,筛选最佳包被抗体和标记抗体,并确定包被抗体包被浓度和标记抗体工作浓度.将其配制成试剂盒,对试剂盒的线性、定量限、准确度和重复性等进行研究.结果 筛选、鉴定8株能稳定分泌B型肉毒毒素特异性单抗的杂交瘤细胞株.8株单抗腹水效价1∶32 000～1∶512 000,重链为IgG类、轻链为κ型,均耐碱、耐热,不耐酸,其中4C11、4D7、7F9和8D2 4株单抗抗原表位差异较大.以4D7为包被抗体、8D2为标记抗体配制试剂盒,B型肉毒毒素滴度在2～32 LD50/mL范围内呈现良好的线性(r=0.996),定量限为0.96 LD50/mL,试剂盒2～8℃有效期为12个月,与A、C、D、E和F型肉毒毒素均无交叉反应.B型肉毒毒素3、6、12、24 LD50/mL的回收率均在85％～115％之间,重复性CV≤15％.结论 筛选得到8株鼠源单抗,建立了B型肉毒毒素快速ELISA检测方法,研制了检测周期短且高灵敏度的B型肉毒毒素ELISA检测试剂盒.
细胞内补体系统(intracellular complement system,ICS)是由位于细胞内的补体成分3(complement component 3,C3)、C5、H因子(factor H,FH)和补体成分1q(complement component 1q,C1q)等多种蛋白质组成的细胞内免疫防御系统.现有研究表明,除肝细胞外,其他许多类型的细胞(如T淋巴细胞、上皮细胞等)都可以产生补体成分,且这些补体成分在细胞内发挥重要作用,影响细胞的代谢、凋亡、分化等多种基本活动.现就细胞内补体系统在多种细胞中的作用及其相关疾病的发生机制等作一概述.
目的 建立一种在现行硫酸铵盐析工艺基础上,采用疏水层析和离子交换层析制备马破伤风免疫球蛋白F(ab')2的层析纯化工艺,以进一步提高该类产品的纯度及比活性,改善其安全性.方法 通过3种不同工艺(传统硫酸铵工艺、传统硫酸铵工艺+一步阴离子交换层析、传统硫酸铵盐析+疏水层析+阴离子交换层析)纯化制备马破伤风免疫球蛋白F(ab')2,然后检测各产物的比活性、纯度、聚合物含量等.结果 采用硫酸铵盐析工艺结合疏水层析和离子交换层析制备的马破伤风免疫球蛋白F(ab')2,比活性均＞100 000 IU/g,分子排阻高效液相色谱法检测F(ab')2含量＞97.0％,完整IgG和聚合物含量之和降至0.5％以下,产品质量大幅提升.结论 建立的马破伤风免疫球蛋白F(ab')2的层析纯化工艺能有效地提高该类产品的纯度、比活性等关键质量,改善产品的安全性,且工艺可控性较好,易于生产放大,适用于马破伤风免疫球蛋白F(ab')2的规模化生产.
脂质是生物膜(亚细胞)的结构与功能基础,其参与多种生理及疾病过程.脂质代谢已被证实在多种病毒入胞、复制、组装、分泌等各个环节发挥重要作用.登革病毒(dengue virus,DENV)是黄病毒属家族重要成员,脂质代谢紊乱是其感染典型临床特征.同时DENV与脂质代谢相互作用参与病毒复制、致病机制过程已成为基础研究及抗病毒治疗的热点领域.过去10年间,DENV对于脂质代谢的调控及利用得到了进一步的认知和阐明.现就DENV感染影响宿主脂质代谢平衡并利用脂质代谢参与病毒复制机制作一概述.
目的 从轮状病毒阳性的临床粪便标本中,分离出1株人G9型轮状病毒野毒株.方法 从轮状病毒感染腹泻婴儿的粪便标本中,用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,接种于单层恒河猴肾细胞(MA-104)上,置于36℃、5.0％CO2细胞培养箱培养,根据细胞病变(cytopathic effect,CPE)收获病毒培养液;连续传代5次后,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)带型和VP7基因测序结果,对VP7为G9型的标本进行5次空斑克隆纯化,最后通过病毒全基因组二代测序鉴定毒株的基因型别;蛋白印迹试验(Western blot)和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测分离毒株;电镜观察鉴定病毒形态;按照《中华人民共和国药典》2020版(三部)(简称《中国药典》)的方法检测分离毒株的纯净性;半数细胞感染病变法(CCID50)测定培养上清的病毒滴度;对分离毒株进行连续传代,观察其传代稳定性.结果 PAGE显示分离株电泳型为长型,11条带呈现A组轮状病毒独特的4 ∶2 ∶3∶2排列电泳图谱;VP7基因测序及全基因组二代测序结果显示此毒株为G9 P[8]型轮状病毒;IFA和Western blot结果显示分离的病毒株为轮状病毒;电镜检测到直径约75 nm的典型的轮状病毒颗粒;病毒纯净性检查结果显示病毒株无其他可传播性因子或其他病毒感染;CCID50法测定病毒滴度为5.50～6.50 lgCCID50/mL;连续传代结果显示分离毒株可以在体外稳定传代.结论 成功分离出1株能够在体外稳定传代的人G9P[8]型轮状病毒野毒株,被命名为HN-28株.
疫苗(vaccine)是一种在公共健康领域内预防传染性疾病暴发及流行最经济有效的产品.信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)技术的不断发展,为mRNA疫苗这一新型疫苗在新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019,COVID-19)大流行期间的快速研发、生产和应用奠定了基础.COVID-19在全球暴发不到一年的时间内,BNT162b2与mRNA-1273疫苗相继获批上市,从临床试验和大规模接种后的数据统计分析来看,2款疫苗均显示出了良好的安全性和保护效率.mRNA疫苗因其生产快捷的特点使其在应对突发性传染病方面拥有巨大的优势,现就mRNA疫苗的制备及现阶段在规模化生产过程中的工艺选择作一概述.
假病毒(pseudovirus)是一种被人为删除关键毒力基因、截短病毒基因3'端的长末端重复序列且丧失致病力的缺陷型病毒.假病毒核衣壳部分与野生型病毒一致,但包膜蛋白可替换为高传染性、高致病性病毒的包膜蛋白.因此,可通过更换假病毒的包膜蛋白,使其能替代各种野生型高致病性病毒在生物安全等级2级或1级条件下进行烈性病毒相关研究和疫苗研发.现就假病毒的发展现状及其在不同包膜病毒研究中的应用作一概述.
目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RABV)G蛋白的假病毒,为RABV中和抗体检测及疫苗的研发提供有效实验工具.方法 通过无缝克隆技术构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G,通过抗体中和试验评估狂犬疫苗接种者体内的中和抗体水平.结果 成功在293T细胞内进行假病毒p-RABV-G的包装,p-RABV-G可以表达G蛋白,并能高效感染Huh7.5细胞.4位狂犬疫苗接种者21 d的血清对p-RABV-G的抑制效果处于最优水平,在1∶625倍数的稀释条件下对p-RABV-G的抑制率高达95.79％、98.26％、98.42％和98.88％.结论 成功构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G可用于狂犬疫苗的开发与中和抗体的筛选.在狂犬疫苗接种后的111 d,本文调查的4位接种者中的其中3位体内血清仍可对p-RABV-G产生抑制效果.
