基于绿豆发状根的快速CRISPR/Cas9基因编辑方法

由于缺乏有效稳定的遗传转化体系,导致基因编辑技术在绿豆中的应用受到极大限制,也使绿豆基因功能研究受到极大阻碍.因此,建立一套基于发根农杆菌的操作简便、快速且高效的绿豆嵌合植株转化技术,可以为绿豆基因功能研究提供技术支撑.首先在 CRISPR/Cas9 载体骨架中插入 1 个绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达框用于阳性发状根的快速筛选,然后将含有靶标基因gRNA的CRISPR/Cas9 质粒导入发根农杆菌K599.菌液注射侵染绿豆幼苗植株下胚轴,评价K599 在绿豆中诱导发状根发生及CRISPR/Cas9 系统在绿豆转基因发状根组织中的效率.结果显示,K599 菌液侵染种植7d的绿豆幼苗植株并在保湿条件下培养 3 周可在侵染点诱导发状根产生,此嵌合植株在切除原生根后可在霍格兰培养液中正常生长且培养 1 周后即可用于后续检测.用GFP筛选的结果显示,阳性发状根占比约为(57.8±10.0)％.随机选择 15 个荧光检测阳性的转基因发状根组织,利用测序检测靶位点的编辑效果,结果显示有 10 个靶位点的序列发生了突变,突变比例达到 67％,其中碱基缺失突变 9 个,碱基转换突变 1 个.由本研究结果可知,利用该方法可以在无菌组织培养的条件下于4 周内获得目的基因编辑的转基因组织,极大地便利了绿豆分子水平上的功能研究,也为其他尚缺乏稳定遗传转化体系的作物进行基因功能研究提供了参考.