Рецепторные тирозинкиназы интегральные мембранные белки, которые активируются при латеральной гомо- или гетеродимеризации, осуществляемой с участием их трансмембранного домена. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в передаче межклеточного сигнала, а полиморфизм и мутации в их трансмембранных доменах ассоциированы с рядом заболеваний человека. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста, ErbB, представляет собой важный класс рецепторных тирозинкиназ, которые участвуют в процессах роста, развития и дифференцировки клеток человека. В настоящей работе для изучения влияния патогенных мутаций на структурно-динамические свойства и специфическое взаимодействие трансмембранных доменов рецепторов семейства ErbB созданы высокоэффективные системы бактериальной экспрессии и очистки рекомбинантных трансмембранных фрагментов ErbB2641-684 с проонкогенными заменами остатка Val659 на остатки Glu или Gln. Трансмембранные фрагменты нарабатывали в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysS в составе гибрида с тиоредоксином А. Протокол выделения и очистки включает металлохелатную аффинную и катионообменную хроматографии. Использование тромбина для гидролиза гибридного белка позволяет снизить финансовые затраты по сравнению с аналогичными протоколами. Описанные методики позволяют получить миллиграммовые количества мутантных трансмембранных фрагментов ErbB, а также их изотопно-меченых производных для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения в мембраноподобном окружении.
原文链接
分享
引用
