高效表达型T克隆载体的构建及其特性
Chinese Journal of Laboratory Diagnosis（2009）
摘要
目的 研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析.方法 限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性.结果 成功构建了表达型T载体,外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达1∶640.结论 新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析.
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关键词
gene expression,gene cloning,expression T-vector
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