RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系的构建

目的 利用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,建立RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系.方法 设计针对RYBP基因的5条短发夹状RNA( shRNA)序列,构建RYBPshRNA慢病毒重组载体,分别包装成慢病毒颗粒,直接感染HL-60细胞,同时设空载体和阴性对照shRNA慢病毒对照组.通过观察绿色荧光蛋白表达以监测感染效率,经嘌呤霉素(终质量浓度8 μg/ml)筛选出稳定感染细胞.Western blot实验初步鉴定出蛋白水平最低的RYBPshRNA组,用实时定量聚合酶链反应(PCR)进一步检测该组细胞mRNA表达水平.结果 慢病毒感染的HL-60细胞经嘌呤霉素筛选成功,与对照组比较,5条RYBP shRNA组细胞RYBP表达均有不同程度减低(P＜0.01),其中以shRNA2沉默效果最佳,且shRNA2组的RYBP基因mRNA水平降低了95％以上(P＜0.05).结论 慢病毒介导的shRNA2能高效、稳定地沉默RYBP基因的表达,成功构建了RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系.