三种亚型软骨组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的 分离培养猪不同亚型软骨组织(弹性软骨、透明软骨以及纤维软骨)来源干细胞并鉴定,为软骨组织工程提供理想种子细胞.方法 利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞,并进行传代.倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达水平(阳性标志物CD29、CD90及阴性标志物CD34、CD45),单克隆形成实验鉴定软骨干细胞单克隆形成能力.三向诱导分化鉴定软骨来源干细胞的成软骨、成骨及成脂多向分化潜能.RT-PCR检测成骨(Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原)、成软骨[蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原]、成脂[脂联素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)]相关基因表达,并以猪BMSCs作为对照.结果 通过纤维连接蛋白黏附法分别从耳软骨(弹性软骨)、关节软骨(透明软骨)、椎间盘软骨(纤维软骨)分选出一群细胞,细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD29、CD90,几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45.经过体外2周培养,单个细胞均能形成细胞克隆.三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能力.RT-PCR结果显示,成骨诱导后关节和椎间盘来源软骨干细胞的Ⅰ、Ⅹ型胶原基因相对表达量明显高于BMSCs(P＜0.05),耳软骨来源干细胞与BMSCs比较差异无统计学意义(P＞0.05);成软骨诱导后,3种亚型软骨组织来源干细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原基因相对表达量均高于BMSCs (P＜0.05);成脂诱导后,3种来源软骨干细胞Adiponectin及FAS基因相对表达量均低于BMSCs,但比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞,具有干细胞的典型特征.