小鼠黏蛋白1(MUC1)基因的体外转录及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的 体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达.方法 通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-MUC1.双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引物中引入血凝素标签(HA TAG)序列,PCR扩增MUC1-HA TAG融合基因片段,然后克隆至表达载体pcDNA3.1(+),重组载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后作为模板,PCR扩增获得含T7启动子和MUC1-HA TAG融合基因片段的PCR产物作为体外转录模板,通过体外转录、加尾、纯化最终获得修饰的MUC1 mRNA.通过多种转染试剂将体外转录MUC1-HA TAG mRNA转入NIH/3T3细胞,Western blot法检测融合蛋白MUC1-HA TAG的表达.结果 反转录PCR扩增的MUC1基因长度约为1900 bp,酶切鉴定和序列分析证实MUC1-HA TAG融合基因已成功插入pcDNA3.1(+)质粒.插入序列与GenBank中小鼠的MUC1基因序列完全一致,HA TAG正确插入MUC1下游,读框正确.Western blot法分析证实体外转录修饰的MUC1-HA TAG mRNA能在NIH/3T3细胞中表达.结论 体外转录修饰的小鼠MUC1-HA TAG mRNA能在哺乳动物NIH/3T3细胞中翻译表达.