Estudo de genes diferencialmente expressos em Leishmania infantum para compreensão do mecanismo de ação do antileishmanial furoxano 14e

Introducao: As doencas parasitarias atingem diversas pessoas por todo o mundo, principalmente em paises subdesenvolvidos e dentre elas, destacam-se as leishmanioses, com incidencia anual de 2 milhoes de casos e 350 milhoes de pessoas vivendo em areas sob risco de contrair esta doenca. Os farmacos atualmente utilizados no tratamento desta parasitose sao toxicos e pouco eficazes, tornando importantes pesquisas para propor novos farmacos. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa em colaboracao com o LAPDESF da FCF-UNESP de Araraquara sintetizou e caracterizou derivados furoxanos com importantes propriedades antiparasitarias, eficazes na eliminacao de L. infantum em hamsters infectados com L. infantum. Esta atividade parece estar associada com a inibicao da enzima cisteino protease do parasito e pela liberacao de oxido nitrico (NO). Dados proteomicos obtidos apos exposicao de formas promastigotas do parasito ao composto 14e, revelaram algumas proteinas diferencialmente expressas, incluindo aquelas envolvidas na detoxificacao do parasito a Especies Reativas de Oxigenio (EROs/ Nitrogenio (ERNs). Objetivo: Avaliar a expressao diferencial de genes de L. infantum quando expostos ao derivado furoxano 14e. Metodologia: Empregou-se o metodo ??CT nos ensaios de PCR em Tempo Real quantitativo (qPCR). Para isso, foram desenhados primers para as regioes genicas codificadoras das proteinas superexpressas (ATP sintase, Calmodulina, Calpaina, Calrreticulina, Chaperoninas HSP60 e HSP70, Citocromo C oxidase subunidade IV, Peroxidoxina, Tioredoxina) seguido de analise dos parâmetros slope, R², eficiencia e curva de melting paratodas as curvas de eficiencia dos primers. Posteriormente, os primers foram utilizados na metodologia ??CT para os grupos experimentais correspondentes a promastigotas de L. infantum cultivadas na presenca ou ausencia de 14e. Resultados e discussao: Para cada par de primer analisado, verificou-se que os valores obtidos para os parâmetros R2 (0,9 = 1), slope (-3,3 = -3,5), eficiencia (90% = 110%) estao adequados para prosseguimento da validacao dos dados proteomicos. A determinacao da curva de melting destes primers tambem sugere ausencia de formacao de dimeros ou hairpin. A analise de qPCR utilizando o metodo ??CT, obteve como resultado que proteinas que se mostraram superexpressas na proteomica tiveram os niveis de expressao proteica correlacionados com os niveis de expressao na fase transcricional. Conclusao: Os primers desenhados para analise de expressao dos genes em estudo estao adequados experimentalmente para a analise. Apos 72 horas de tratamento com o antileishmanial 14e houve alteracao no nivel transcricional de algumas proteinas envolvidas na detoxificacao de EROs/ERNs e em funcoes de organelas como o reticulo endoplasmaticoe mitocondriacomo uma possivel forma da Leishmania tentar reverter os efeitos gerados pelo 14e.