丙酮酸乙酯对脂多糖刺激下人肾小管上皮细胞线粒体动力学的影响

目的 探讨丙酮酸乙酯(EP)对内毒素处理的人肾小管上皮细胞(HK-2)线粒体动力学及细胞凋亡的影响.方法 将购买的HK-2细胞分为3组:脂多糖(LPS)组使用800μg/L的LPS刺激HK-2细胞24 h;EP组使用800μg/L的LPS与0.25 mmol/L的EP混合物刺激HK-2细胞24 h;对照组(NC组)以同体积生理盐水刺激HK-2细胞24 h.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平;采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞线粒体膜电位;采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测线粒体动力学蛋白凋亡相关蛋白激酶2(DAPK-2)、线粒体融合蛋白(Mfn-1、Mfn-2)、凋亡相关蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase-3、caspase-9)、Bcl-2、Bcl-xL、细胞色素C(Cyt C)以及DNA修复酶多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)的表达.结果 与NC组比较,LPS组细胞MDA、IL-6、TNF-α表达显著增高,SOD活性显著降低,细胞线粒体膜电位及细胞内ATP水平显著降低,细胞线粒体分裂蛋白DAPK-2表达显著增高,而线粒体融合蛋白Mfn-1、Mfn-2表达显著降低,细胞总凋亡率显著增高,同时凋亡蛋白caspase-3、caspase-9及Cyt C的表达显著增高,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL以及PARP的表达显著降低.与LPS组比较,EP可抑制上述氧化应激指标、炎性因子的表达〔MDA(μmol/L):12.35±2.21比45.95±1.76,SOD(kU/L):54.68±1.42比40.73±1.60,IL-6(ng/L):67.87±2.61比338.92±20.91,TNF-α(ng/L):19.23±1.80比180.69±6.51〕,细胞线粒体膜电位及细胞内ATP水平显著增高〔线粒体膜电位(正常细胞百分比):(99.43±0.25)％ 比(69.40±0.75)％,ATP(×106 RLU):0.19±0.01比0.12±0.05〕,线粒体分裂蛋白表达显著降低(DAPK-2/β-actin:0.03±0.01比0.61±0.02),融合蛋白显著增多(Mfn-1/β-actin:0.43±0.04比0.17±0.01,Mfn-2/β-actin:0.201±0.004比0.001±0.001),细胞总凋亡率显著降低〔(5.25±0.17)％比(34.42±0.64)％〕,凋亡蛋白表达显著降低(caspase-3/β-actin:0.25±0.15比1.76±0.01,caspase-9/β-actin:0.09±0.02比1.52±0.12,Cyt C/β-actin:0.001±0.001比0.350±0.030),抗凋亡蛋白及DNA修复酶的表达显著升高(Bcl-2/β-actin:0.500±0.010比0.009±0.004,Bcl-xL/β-actin:0.550±0.010比0.009±0.001,PARP/β-actin:0.94±0.01比0.16±0.13),差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 内毒素刺激下的人肾小管上皮细胞存在线粒体过度分裂/融合不足;EP可通过调节线粒体动力学来保护线粒体功能,从而降低内毒素诱导的人肾小管上皮细胞凋亡率.