基于细菌16S rRNA基因的PCR扩增与测序分析在临床不常见菌鉴定中的应用

目的 探讨细菌16S rRNA基因的广谱PCR扩增与测序分析在临床分离的少见病原菌的鉴定及分类中的价值.方法 收集2010年12月至2011年9月来自7家不同医院和机构,常规方法难以鉴定或具有特殊表型的少见菌48株,以及仪器法连续监测报警阳性、但二次传代无细菌生长的液体增菌培养瓶7个,采用细菌16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因MicroSeq 500试剂盒、通用引物27f-1492r、27f-1525r进行广谱PCR扩增及目的片段的基因测序.运用美国国立生物信息中心“基于局部比对算法的搜索工具( Blast)”,结合“具有法定分类学地位的原核生物名称目录(http://www.bacterio.cict.fr/)”提供的分类学信息,比较待鉴定细菌与近缘种模式菌株基因序列的相似程度；参考美国临床与实验室标准化协会(CLSI) MM18-A的解释标准,以确定待鉴定细菌的种属及分类学位置.结果 采用广谱PCR测定,7份假阳性血培养瓶中,2份扩增到细菌的16S rRNA基因,经序列分析鉴定均为肺炎链球菌.48株不同来源、不同种属的少见菌,均扩增到16S rRNA基因目的片段并成功测序,参考CLSI MM18-A的解释标准,35株(72.9％)直接鉴定到“种”,11株(22.9％)鉴定到“属”,另2株鉴定为可能的新属新种.进一步结合细菌的生化反应特征及其他管家基因序列分析结果,则可鉴定到“种”的细菌可增加到42株(87.5％),其中包括链杆菌、嗜二氧化碳噬纤维菌、玫瑰单胞菌、奴卡菌、弯曲菌、分枝杆菌等具有明确临床意义的少见菌,以及多株近十年内命名的新细菌,如小不动杆菌、富西哑分枝杆菌、黏液玫瑰单胞菌、Halomonas johnsoniae等.此外,还发现了1个新亚型的胎儿弯曲菌.结论 16S rRNA基因测序鉴定能明确提供细菌的遗传学信息,且无种属选择性,对临床少见菌、苛养菌、以及固体培养基不生长的纯培养物等具有独特的优势,是病原微生物鉴定的发展方向.