一种大鼠肝癌干细胞的离心富集方法0.

目的 建立一种富集大鼠肝癌干细胞的方法,并检测此种方法分离得到的细胞是否具有肿瘤干细胞的生物学特征.方法 二乙基亚硝胺(DENA)腹腔注射构建大鼠肝癌模型,两步胶原酶灌注法分离肝癌细胞并体外培养,Percoll连续梯度密度离心法将细胞分成4层,采用流式细胞仪检测各层细胞的肝癌干细胞表面标志上皮细胞黏附因子(EpCAM)、甲胎蛋白(AFP)的表达,并用实时-聚合酶链反应( Real-time PCR)验证EpCAM、CD133、AFP的mRNA表达.绘制生长曲线检测各层细胞增殖能力,Transwell小室检测各层细胞的侵袭能力.结果 Percoll离心所得4层细胞中,第3层细胞是富集肝癌干细胞最多的一层,具有最强的增殖能力.第3层细胞EpCAM与AFP阳性表达最高,分别为( 84.50±8.31)％和(85.20±8.31)％,与其他各层比较,差异有统计学意义(P＜0.05).经Real-time PCR 验证,第3层细胞的EpCAM和AFP mRNA表达最高,分别为(111.34±5.59)和(13.76±0.95),与其他各层比较,差异有统计学意义(P＜0.05),第3层的CD133表达为(17.16±0.42),与第2层、4层比较,差异有统计学意义(P＜0.05),但与第1层比较,差异无统计学意义(P＞0.05).侵袭实验可见第3层细胞穿透的数量最多(92.750±4.432),与其他各层比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 利用Percoll 连续梯度密度离心法成功地富集了肝癌干细胞,经验证符合肿瘤干细胞生物学特性,为肝癌的靶向治疗、多重耐药等基础研究提供了确切的研究对象.