靶向胶质瘤的敲除程序死亡受体-1基因表皮生长因子突变受体Ⅲ嵌合抗原受体T细胞的构建和功能鉴定

目的 构建敲除程序死亡受体-1(PD-1)基因的靶向表皮生长因子突变受体Ⅲ(EGFRvⅢ)阳性胶质瘤细胞的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,评估其在体外和体内对EGFRvⅢ阳性胶质瘤细胞的杀伤作用.方法 运用电转染技术构建靶向EGFRvⅢ抗原的CAR-T细胞,并用基因打靶技术(CRISPR/Cas9)敲除其PD-1基因,获得PD-1ko EGFRvⅢCAR-T细胞;流式细胞术、聚合酶链反应(PCR)和酶切法验证PD-1 ko EGFRvⅢCAR-T细胞是否构建成功;流式细胞术及乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒检测PD-1ko EGFRvⅢCAR-T细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用.选取15只6～8周龄雌性BALB/c-nude小鼠,构建肿瘤模型,随机分为PD-1ko EGFRvⅢCAR-T细胞组、T细胞组、磷酸盐缓冲液(PBS)组.各组在第28、32和36天分别注入100μl 5×106个PD-1ko CAR-T细胞、T细胞、100 μl PBS.应用SPSS 18.0软件进行统计,计量资料采用均数±标准差表示,两组间均数比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析.结果 PCR及酶切实验显示PD-1ko EGFRvⅢCAR-T细胞PD-1出现了不同条带,验证基因敲除成功.体外实验中,PD-1ko EGFRvⅢCAR-T细胞分泌的细胞因子浓度[白细胞介素(IL)-2:(242.08±19.08) ng/L,干扰素(IFN)-γ:(8 374.8 ±265.82) ng/L]均显著高于T细胞组[IL-2:(153.73±13.23) ng/L,IFN-γ:(2 118.96±29.62) ng/L],差异有统计学意义(IL-2:t=6.589,P＜ 0.05;IFN-γ:t=33.076,P＜ 0.05).细胞毒性实验结果显示PD-1 koEGFRvⅢCAR-T组对胶质瘤细胞杀伤作用显著高于T细胞组及PBS组,且效靶比越高杀伤作用越强.移植瘤裸鼠注射细胞后,PD-1ko EGFRvⅢCAR-T组瘤体体积为(1.06±0.26) cm3,显著小于T细胞的(5.14±1.57) cm3和PBS对照组组瘤体体积为(5.04 ±0.61) cm3,3组比较差异均有统计学意义(F=22.290,P＜0.05).结论 PD-1 ko EGFRvⅢCAR-T细胞具有良好的抑瘤效果.