基于RPA-LFD的日本血吸虫循环核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价

目的 结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术及侧流层析试纸条法(LFD)建立日本血吸虫特异核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其检测日本血吸虫感染小鼠血清中血吸虫循环核酸的应用价值. 方法 以日本血吸虫非长末端重复序列逆转录转座子SjCHGCS19为靶标,设计RPA引物和探针,以日本血吸虫基因组DNA为模板进行RPA及LFD检测,并优化RPA反应温度及时间,建立日本血吸虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法.用RPA-LFD检测模板量为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7 ng的日本血吸虫基因组DNA,评价其敏感性;用RPA-LFD方法检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫基因组DNA,评价其特异性.制备含0.01、0.1、1、10和100 ng日本血吸虫成虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清.用40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采集并分离感染前及感染后7、21、35 d小鼠尾静脉血清.提取模拟阳性鼠血清、感染小鼠血清样品中的循环DNA,评价RPA-LFD检测血清中血吸虫特异核酸的可行性及其早期检测价值. 结果 建立了快速可视化检测SjCHGCS19重复序列的RPA-LFD方法,30～45℃反应10 min即可检出目的片段.RPA最优反应条件为39℃,20 min.RPA-LFD对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限为10-6 ng(1fg).特异性评价结果显示,RPA-LFD检测曼氏血吸虫和埃及血吸虫基因组DNA结果为阳性,检测卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果为阴性.RPA-LFD方法可成功检出含0.01～100 ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清以及血吸虫感染后7、21、35 d鼠血清中的游离SjCHGCS19 DNA片段. 结论 建立了一种快速、可视化检测日本血吸虫循环核酸的RPA-LFD方法,该方法敏感性高,具有检测血吸虫早期感染的潜在应用价值.