嗜热芽孢杆菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达纯化及活性分析

偶联法测定酶的活性是常用酶活测定方法之一.核苷二磷酸(NDP)是核苷三磷酸的β,γ高能磷酸键水解产物之一,丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)是用来测定NDP生成的常用偶联酶.为了分析嗜热菌苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus JH-7)(最适生长温度为50℃)的PK和LDH是否可以作为50℃条件下的偶联酶,研究从Aeribacillus pallidus JH-7基因组中克隆pk和ldh,连接到表达载体pET24a.结果 表明,经诱导表达、纯化得到纯度达95％以上的ApPK和ApLDH.并利用分光光度法,分别对ApLDH和ApPK的动力学常数及催化效率进行了分析.结果 表明,ApPK对NDP的最适底物为ADP,催化效率为5×104 mol/(L·s),最适pH值为8.0,最适温度为45℃;NADH为ApLDH的最适底物,催化效率为3.7 × 105 mol/(L·s),最适pH值为5.8,最适温度为35℃.虽然50℃不是ApLDH和ApPK的最适温度,但它们在此温度下的krat分别为16.4,64.5 s-1,暗示它们可以作为此温度下的偶联酶.