大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件，确定其酶学性质，为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株，首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围，并在单因素试验的基础上，以漆酶酶活力为响应值，采用central composite design（CCD）响应面设计试验，利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析，优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分；初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶，以ABTS为反应底物，设置不同温度及pH，测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性，进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值，确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型，模型差异显著（P=0.0001），可以用该模型来拟合试验；响应面分析结果表明，各因素对漆酶活力的影响大小依次为 Cu2+>葡萄糖>尿素，而葡萄糖和尿素交互作用极显著；通过拟合求出模型极值点，对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L-1，KH2PO41 g?L-1，尿素1.46 g?L-1，MgSO40.5 g?L-1，蛋白胨2 g?L-1，玉米浆0.5 g?L-1，CuSO40.07 g·L-1， Tween803 mL?L-1，28℃，150 r/min振荡培养7 d；在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离，经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD；以ABTS为底物时，最适反应温度为50℃，最适pH为4.2，在温度较高且弱酸性条件下活性较高，并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性，常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变，50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上；进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L-1，最大反应速率Vm为28.63 mmol?L-1?min-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性，表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性，可进一步研究开发应用。